抗FXI/FXIa抗体、其抗原结合片段及医药用途的制作方法

本技术涉及抗fxi/fxia抗体、其抗原结合片段，包含所述抗fxi/fxia抗体及其抗原结合片段的药物组合物，及其用于治疗或预防血栓形成相关疾病的医药用途。

背景技术：

1、近年来，随着全球人口老龄化以及生活方式的改变，血栓栓塞类疾病成为全球致死率和致残率最高的疾病之一。现有的抗血栓药物/抗凝药物所造成的不希望的出血事件，仍然是一个很大的问题(katherine et al，2015，west j emerg med；16(1):11–17)。

2、现有动物实验和临床数据证明，抑制内源性途径，特别是凝血因子fxi，能够在降低血栓形成的同时不会造成明显的出血事件(felicitas müller et al，curr opinhematol.2011 sep；18(5):349–355)。

3、fxi是内源途径中的关键凝血因子。fxia是fxi的活化状态，在凝血级联反应中，不仅能够被内源凝血因子fxiia激活形成fxia，而且能够被凝血酶ii激活，从而放大凝血级联反应，形成更多的凝血酶和纤维蛋白。该过程中，可能形成过多的凝血酶和纤维蛋白，从而导致血栓类疾病。从人类fxi缺乏症(c型血友病)病人出血表型温和的特点发现，fxi被抑制时出血风险较小。进一步的研究发现，在fxi缺陷病人中，缺血性脑卒中及深静脉血栓的发病率明显降低，表明抑制fxi有利于减少缺血性脑卒中及深静脉血栓发病风险。

4、fxi基因位于人类第4号染色体，编码由607个氨基酸组成的分泌蛋白。fxi蛋白分子包含4个苹果结构域(apple domains)和1个催化结构域(catalytic domain)。fxi在人血液内是以同二聚体的形式存在，循环在人血浆中与hk形成非共价复合物的fxi的浓度为约30nm(15-45nm)。人fxi分子与猴和小鼠的fxi分子分别具有88％、67％和58％(两个物种，三个同源性数据)的同源性。

5、目前已经有多篇文献和临床试验表明，抑制fxi及其转化成的fxia的活性能够有效的降低血栓的形成，并且不会造成可见的出血风险。从目前披露的临床结果来看，相对于现有的口服抗凝剂(noac)，抗fxi/fxia抗体有着相似或更好的抗血栓效果的同时，出血风险更低，患者能够得到更安全的治疗。

6、提供低免疫原性、有效抑制血栓形成而不增加出血风险的抗fxi/fxia抗体药物，从而使得抗血栓治疗更安全，仍然是医药领域亟需的。

技术实现思路

1、本公开提供一种抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，其编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、其用于治疗或延缓血栓形成或血栓栓塞相关疾病或病症或其并发症的方法，及其检测用途。

2、一方面，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，包含：

3、重链hcdr1，其包含x1x2x3mh(seq id no：63)所示序列，其中，x1选自e、s、g或d，x2选自l、i、v或d，x3选自s、f、l或y；和/或

4、重链hcdr2，其包含x4x5dpx6x7gx8tx9yax10kfqg(seq id no：64)所示序列，其中，x4选自g或w，x5选自f或i，x6选自e或q，x7选自d或n，x8选自e或d，x9选自i、r、v或e；x10选自q或s；和/或

5、重链hcdr3，其包含dphrtwwryfdwlyprgmdv(seq id no：9)或gnfyyfdy(seq idno：39)所示序列；和/或

6、轻链lcdr1，其包含rasqtvgknyla(seq id no：10)或sasssinymh(seq id no：40)所示序列；和/或

7、轻链lcdr2，其包含x11x12sx13x14ax15(seq id no：65)所示序列，其中，x11选自g、e或d，x12选自a或t，x13选自n、v或k，x14选自r或l，x15选自t、l或s；和/或

8、轻链lcdr3，其包含x17qx18x19x20x21px22t(seq id no：66)所示序列，x17选自q或h，x18选自f或r，x19选自r或s，x20选自s或f，x21选自y或s，x22选自y或l。

9、在一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含：

10、重链hcdr1，其包含seq id no：7、22、24、26、28、37之一所示序列；

11、重链hcdr2，其包含seq id no：8、23、25、27、38之一所示序列；

12、重链hcdr3，其包含seq id no：9、39之一所示序列；

13、轻链lcdr1，其包含seq id no：10、40之一所示序列；

14、轻链lcdr2，其包含seq id no：11、29、41之一所示序列；和

15、轻链lcdr3，其包含seq id no：12、42之一所示序列。

16、在一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段中，包含：

17、(a)重链hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no：7、8、9所示序列，轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no：10、11、12所示序列；

18、(b)重链hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no：22、23、9所示序列，轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no：10、29、12所示序列；

19、(c)重链hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no：24、25、9所示序列，轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no：10、29、12所示序列；

20、(d)重链hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no：26、27、9所示序列，轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no：10、29、12所示序列；

21、(e)重链hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no：28、25、9所示序列，轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no：10、29、12所示序列；

22、(f)重链hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no：37、38、39所示序列，轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no：40、41、42所示序列；

23、(g)重链hcdr，其与(a)-(f)中任一重链的hcdr相比，具有0-10个氨基酸突变，轻链cdr，其与(a)-(f)中任一轻链的lcdr相比具有0-10个氨基酸突变。

24、一些实施方案中，当抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或相关的(g)方案的cdr序列时，其选择性的结合fxia，而不结合fxi。

25、另一些实施方案中，当抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含(f)或相关的(g)方案的cdr序列时，其结合fxi，也结合fxia；一些具体的实施方案中，其虽然结合fxia，但不影响fxia活性。

26、在一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其片段；一些具体实施方案中，为人源化抗体、人抗体或其片段。其可以为全长抗体或其其片段。

27、在一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段，人源化的轻链模板可以为igkv3-11*01，重链模板可以为ighv1-69-2*01。

28、在一些实施方案中，人源化过程还包括对vh、vl的回复突变。一些具体实施方案中，例如，vh具有y27f、t28n、f29i、t30k、a93l、r94y、e73t、r66k、v67a、t75a、t76n中任一或任意组合的回复突变。一些具体实施方案中，vl具有r45k、l46r、l47w、i58v、f71y中任一或任意组合的回复突变。

29、一些具体实施方案中，上述人源化抗体或其片段的重链hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no：37、38、39所示序列，轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no：40、41、42所示序列。

30、在一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含：

31、如seq id no：5、17-20、30-33、35、43、45-49、53-58之一所示或与之具有至少之具有至少80％同一性的vh，和/或

32、如seq id no：6、21、34、36、44、50-52之一所示或与之具有至少80％同一性的vl。

33、一些具体实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含：

34、(h)如seq id no：5所示或与之具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：6所示或具有至少80％同一性的vl；

35、(i)如seq id no：17所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：21所示或具有至少80％同一性的vl；

36、(j)如seq id no：18所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：21所示或具有至少80％同一性的vl；

37、(k)如seq id no：19所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：21所示或具有至少80％同一性的vl；

38、(l)如seq id no：20所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：21所示或具有至少80％同一性的vl；

39、(m)如seq id no：30所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：34所示或具有至少80％同一性的vl；

40、(n)如seq id no：31所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：34所示或具有至少80％同一性的vl；

41、(o)如seq id no：32所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：34所示或具有至少80％同一性的vl；

42、(p)如seq id no：35所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：36所示或具有至少80％同一性的vl；

43、(q)如seq id no：43所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：44所示或具有至少80％同一性的vl；

44、(r)如seq id no：45所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：51所示或具有至少80％同一性的vl；

45、(s)如seq id no：49所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：51所示或具有至少80％同一性的vl；

46、(t)如seq id no：58所示或具有至少80％同一性的vh，和如seq id no：51所示或具有至少80％同一性的vl。

47、一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段的vh与人源或小鼠ch1连接，vl与人源或小鼠cl或cκ连接。所述人源ch如seq id no：13或59所示，所述cκ例如seq idno：14所示。

48、一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。其轻链可变区包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链fr区和/或轻链恒定区。一些具体实施方案中，所述鼠源抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含鼠源igg1、igg2、igg3、igg4或其变体的重链fr区和/或重链恒定区。

49、一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其片段。其包含人源κ、λ链或其变体的轻链fr区和/或轻链恒定区，和/或人源igg1、igg2、igg3或igg4或其变体的重链fr区和/或重链恒定区。

50、一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含恒定区fc，例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg4p(即igg4的s241p突变体)的fc。所述igg1的fc序列例如seq id no：67所示，所述igg4p fc(即包含s241p的igg4fc)的序列例如seq id no：60所示。

51、一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段的重链如seq id no：15所示或与之具有至少80％同一性，轻链如seq id no：16所示或与之具有至少80％同一性；或

52、重链如seq id no：61所示或与之具有至少80％同一性，轻链如seq id no：62所示或与之具有至少80％同一性。

53、一些实施方案中，抗fxi/fxia抗体的抗原结合片段为fab、fv、sfv、fab’、f(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scfv、sdab、sdfv、纳米抗体、肽抗体(peptibody)、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)和四链抗体(tetrabody)、串联二-scfv、串联三-scfv)，例如具体为scfv、fv、fab或fab’片段。

54、一些实施方案中，提供一种抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，其结合与前述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段相同的表位。

55、另一些实施方案中，提供抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，其交叉阻断前述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段与人fxi/fxia的结合。

56、另一些实施方案中，提供抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，其与人fxi/fxia的结合被前述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段交叉所阻断。

57、一些实施方案中，提供抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，与前述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链具有至少80％同一性。

58、本公开上下文中，“至少80％”涵盖80％及以上，例如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。

59、一些实施方案中，提供抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段变体，在前述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。所述氨基酸变化可以是可变区中的氨基酸残基保守性取代。

60、一些实施方案中，上述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段可以具有以下任一或任几项的特性：

61、防止内在凝血途径或共同凝血途径的活化；

62、阻断fxi和/或fxia结合至凝血途径中的成员(优选地，所述成员选自：凝血因子ix、凝血因子xiia、凝血酶中的一个或多个)；

63、阻断fix、fxi及fxia中的一个或多个结合至血小板受体；

64、具有以≤10-9kd结合至人fxi和/或fxia蛋白；

65、结合至fxi/fxia时，阻止fxi/fxia催化结构域呈现活性构象；

66、可用于皮下给药或静脉给药。

67、上述亲和力的测定方式例如是biacoretm。

68、另一方面，本公开提供一种多核苷酸，其编码前述任一抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段或抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，所述多核苷酸可以是dna或rna。

69、再一方面，本公开提供一种含有如上所述的多核苷酸的表达载体，表达载体选自：真核表达载体、原核表达载体、病毒载体。

70、再一方面，本公开提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞，其可以是真核细胞、或原核细胞。

71、一些实施方案中，所述宿主细胞选自：细菌、酵母菌、哺乳动物细胞。一些具体实施方案中，所述宿主细胞选自：大肠杆菌、毕赤酵母、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或人胚肾(hek)293细胞。

72、再一方面，本公开提供一种用于制备抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在如前所述的宿主细胞中表达该抗体或其抗原结合片段，并自该宿主细胞中分离该抗体或其抗原结合片段。

73、再一方面，本公开提供一种组合物，例如药物组合物，其含有：可药用的赋形剂、稀释或载体；和治疗或预防有效量的如上所述的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段。在一些具体实施方式中，所述药物组合物的单位计量中可含有0.01至99重量％的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，或药物组合物的单位剂量中含抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段的量为0.1-2000mg，在一些具体实施方式中为1-1000mg。

74、一些具体实施方式中，上述药物组合物为皮下给药剂型，或静脉给药剂型。

75、一些实施方案中，提供皮下给药的药物组合物，含有治疗或预防有效量的前述本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段，例如，所述抗体的重链可变区包含seq id no：58所示序列，轻链可变区包含seq id no：51所示序列；例如，所述抗体的重链全长包含seqid no：61所示序列，轻链全长包含seq id no：62所示序列。

76、再一方面，本公开提供选自以下的任一项或组合在制备药物中的用途：根据本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、根据本公开的药物组合物。

77、一些实施方案中，所述药物用于治疗或预防血栓形成或血栓栓塞相关疾病或病症，例如与心房纤维性颤动有关的缺血性中风和/或深层静脉血栓形成。

78、本公开提供一种治疗或预防血栓形成或血栓栓塞相关疾病或病症(或其并发症)或延缓血栓形成或血栓栓塞相关疾病或病症(或其并发症)进展的方法，该方法包括给予受试者治疗或延缓疾病有效量的根据本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、或根据本公开的药物组合物。

79、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物可以应用于凝块形成、血栓形成或血栓栓塞相关疾病或病症。

80、上述血栓形成或血栓栓塞相关疾病或病症包括但不限于：心脏冠状动脉疾病(诸如急性冠状动脉综合征(acs))、有st段升高的心肌梗死(stemi)和无st段升高的心肌梗死(非stemi)、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、冠状动脉介入(诸如血管成形术、支架植入术或主动脉冠状动脉分流术)后的再闭塞和再狭窄，、外周动脉闭塞性疾病、肺栓塞、静脉血栓栓塞、静脉血栓形成(特别是在下肢深静脉和肾静脉中)、短暂性脑缺血发作以及血栓形成性脑卒中和血栓栓塞性脑卒中、由慢性血栓栓塞(cteph)引起的肺病或肺动脉高压。

81、凝血系统的刺激可通过多种诱因或相关病症发生。在外科手术干预、无法移动、卧床、感染、炎症或者癌症或癌症治疗等的情况下，可高度激活凝血系统，并且可能有血栓形成性并发症，特别是静脉血栓。因此，本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物可用于预防外科手术干预情况下的血栓，特别是对于患癌症的患者或者接受整形外科手术(如髋关节或膝关节置换)的患者。因此，本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物还用于预防具有激活的凝血系统的患者的血栓，例如在所述的刺激情况下。

82、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于治疗和/或预防急性、间歇性或持续性心律失常(例如，心房颤动)，或者经历心脏复律，或者患有心脏瓣膜疾病，或者带有人工心脏瓣膜的患者的心源性血栓栓塞(例如，脑动脉缺血、脑卒中以及全身性血栓栓塞和局部血栓栓塞)。

83、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于治疗和/或预防弥漫性血管内凝血(dic)。该疾病的发生可能与败血症特别相关，但也可能归因于外科手术干预、肿瘤疾病、烧伤或其它损伤，并且可能通过微血栓导致严重的器官损伤。

84、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于治疗和/或预防血栓栓塞性并发症。例如，所述并发症可能发生在微血管病性溶血性贫血中以及，因为在体外循环的情况下，血液与外源表面接触而导致并发症(如血液透析、ecmo(“体外膜氧合”)、lvad(“左心室辅助装置”)和类似方法)。

85、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于治疗和/或预防涉及脑血管中微凝块形成或纤维蛋白沉积的疾病，所述疾病可能会导致痴呆症，诸如血管性痴呆或阿尔茨海默病。

86、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于预防和/或治疗癌症患者的血栓形成性和/或血栓栓塞性并发症，例如，静脉血栓栓塞，特别是那些经历了重大外科手术干预或者化疗或放疗的那些患者。

87、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于治疗和/或预防以下疾病背景下的弥漫性血管内凝血，包括但不限于：传染病和/或全身炎症综合征(sirs)、脓毒性器官功能障碍、脓毒性器官衰竭和多器官衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ards)、急性肺损伤(ali)、脓毒性脑卒中和/或脓毒性器官衰竭。在感染的情况中，可能有凝血系统的普遍激活(弥漫性血管内凝血活消耗性凝血，又称“dic”)，伴有多器官中微血栓形成和继发性出血性并发症。可能存在内皮损伤，伴有血管通透性升高以及体液和蛋白质扩散如外渗空间。随着感染发展，可能有器官衰竭(例如，肾衰竭、肝衰竭、呼吸衰竭、中枢神经功能缺损和心血管衰竭)或多器官衰竭。在dic的情况中，在受损内皮细胞表面、异物表面或交联的血管外组织表面上存在凝血系统的大量激活。因此，在患有缺血和随后的器官功能障碍的多个器官的小血管中存在凝血。继发效应是凝血因子(例如因子x、凝血酶原和纤维蛋白原)和血小板的消耗，这降低了血液的凝固性并且可能导致严重出血。

88、本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于治疗和/或预防如下患者的血栓形成性或血栓栓塞性疾病和/或炎性疾病和/或血管通透性升高的疾病：所述患者的基因突变导致酶活性增强或者酶原水平提高，这些通过酶活性或酶原浓度的相关实验/测量来确定。

89、本公开提供本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于制备治疗和/或预防疾病，尤其是上述疾病的药物的用途，例如用于制备治疗和/或预防血栓形成性或血栓栓塞性疾病的药物。

90、本公开提供本公开的抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段、药物组合物用于治疗和/或预防上述疾病的方法。

91、再一方面，本公开提供检测fxi/fxia的组合物，所述组合物包含抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段。本公开还提供用于体内或体外检测fxi/fxia的方法、系统或装置，其包括处理抗fxi/fxia抗体。

92、一些实施方案中，体外检测方法、系统或装置可能例如包括：

93、(1)使待测样品与结合fxi/fxia的抗体或其抗原结合片段接触；

94、(2)检测在结合fxi/fxia的抗体或其抗原结合片段和待测样品之间形成的复合物；和/或

95、(3)使参比样品(例如，对照样品)与抗体接触；和

96、(4)通过与参比样品比较，确定抗体和待测样品之间复合物形成的程度。

97、如与对照样品或受试者中相比，待测样品或受试者中复合物形成的变化(例如，统计学上的显著变化)表示待测样品中存在fxi/fxia。

98、另一些实施方案中，体内检测方法、系统或装置可以包括：

99、(1)向受试者施用结合fxi/fxia的抗体或其抗原结合片段；和

100、(2)检测在结合fxi/fxia的抗体或其抗原结合片段和待测物之间复合物的形成。

101、检测可以包括确定形成复合物的位置或时间。结合fxi/fxia的抗体可以直接或间接地用可检测物质标记，以促进所结合的或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。可以通过测量与fxi/fxia结合或不结合的抗体或使其可视化，检测在结合fxi/fxia的抗体或其抗原结合片段和fxi/fxia之间的复合物形成。可以使用常规检测测定法，例如，酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)或组织免疫组织化学。

102、一些实施方案中，通过竞争免疫测定法分析样品中fxi/fxia的存在，所述竞争免疫测定法使用以可检测物质标记的标准物和未标记的结合fxi/fxia的抗体。

103、一些实施方案中，出于检测目的，本公开的抗体或其片段可以用荧光团和发色团标记。

104、一些实施方案中，还提供试剂盒，所述试剂盒包含抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段；任选地还可以包含诊断使用说明。试剂盒还可以含有至少一种额外的试剂，如标记物或额外的诊断剂。对于体内使用，抗体可以配制为药物组合物。