一种黄花蒿外囊泡提取物及其应用

本发明属于植物来源外囊泡提取的，具体涉及一种黄花蒿外囊泡提取物及其应用。

背景技术：

1、外囊泡是一种40～150nm的生物纳米结构，由大多数类型的细胞分泌，并在所有生命领域的细胞和生物体之间传递信息。外囊泡主要含有蛋白质、脂质和rna等成分，多项研究表明外囊泡具有抗炎、抗肿瘤和抗衰等多种生物活性。植物外囊泡被观察到的时间比哺乳动物外泌体早15年左右，但除了旧的显微镜图像表明外囊泡的存在之外，对植物外囊泡知之甚少。近年来，随着对外囊泡研究的深入，发现植物外囊泡也具有一定的生物活性，而药用植物外囊泡已被发现具有较普遍植物来源外囊泡更为突出的生物活性，在作为治疗剂和药物载体方面展现出独特优势，具有十分广阔的应用前景。

2、我国使用药用植物治疗疾病历史悠久，药用植物中药效物质通过复杂的机制发挥疗效，在保障机体健康中具有重要作用。药用植物外囊泡作为细胞间通讯的重要媒介，在药用植物发挥疗效过程中扮演着重要的角色。现有生姜、人参、姜黄、红景天槲寄生、黄芪和天冬等常用药材或基原植物来源外囊泡的相关文献。大量的研究表明，药用植物外囊泡在疾病的预防和治疗方面具有相当的潜力，值得展开更加广泛的研究。目前，有关黄花蒿来源的外囊泡的提取方法及黄花蒿外囊泡的应用还未见报道。黄花蒿(artemisia annua l.)菊科蒿属植物。中国药典记载黄花蒿性味苦寒，切段干燥后可入药，有清虚热，解暑热，解疟，退黄的功效。鲜品绞汁后可内服也可外敷。

技术实现思路

1、本发明为进一步开发药用植物黄花蒿的药用范围和药用价值，提供了一种黄花蒿外囊泡的提取方法，即提供了一种从黄花蒿这种天然植物中提取出含有青蒿素成分的天然球形外囊泡样纳米粒的方法，外囊泡是一种由哺乳动物或植物分泌的纳米粒结构，一般装载有蛋白质、核酸、脂质和其他生物分子，细胞外囊泡作为生物纳米载体，在促进细胞间远距离通讯中起着至关重要的作用，是一种天然的药物递送纳米载体，通过从植物体中提取外囊泡，具有成本低，递送效率高且不存在人工纳米载体用于载药制备时的空载问题，采用本发明提供的黄花蒿外囊泡的提取方法提取的外囊泡的其他成分也无毒副作用。

2、技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种黄花蒿外囊泡的提取方法，所述提取方法包括步骤：将新鲜黄花蒿整株纯水清洗干净后，再加入纯水研磨得到汁液；将所述汁液依次经过200×g离心10分钟，2000×g离心20分钟，10,000×g离心30分钟，取上清液以去除大颗粒和纤维，将上清液经过100000×g离心处理1h，沉淀悬浮于pbs中；采用蔗糖密度梯度离心法将样品转至15％、30％、45％、60％蔗糖溶液150,000×g离心1h，收集45％蔗糖溶液层，加入与45％蔗糖溶液层等体积等体积的pbs，150,000×g离心1h洗去蔗糖，收集沉淀，后采用无菌pbs重悬，新鲜使用或保存在-80℃，上述离心的离心半径均为39.5mm。

4、采用上述提取方法提取的黄花蒿外囊泡为水合粒径为124.8±0.9nm的球形外囊泡样纳米粒，所述球形外囊泡样纳米粒具有负zeta电位值-26.7±0.87mv。

5、第二方面，本发明还提供了上述提取方法提取的黄花蒿外囊泡提取物在制备调节免疫微环境药物中的应用即作为一种免疫调节剂，作为免疫调节剂，上述黄花蒿外囊泡能够促进巨噬细胞由m2样表型向m1表型的极化，发挥免疫调节作用；

6、第三方面，本发明还提供了上述提取的黄花蒿外囊泡提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，经过所述黄花蒿外囊泡刺激的巨噬细胞能够抑制肿瘤生长，可用于制作肿瘤免疫治疗的纳米药物。

7、有益效果：

8、采用本发明提供一种黄花蒿外囊泡的提取方法提取的黄花蒿外囊泡提取物中含有球形外囊泡样纳米粒，具体的，通过验证，这种粒径在124.8nm左右的球形外囊泡样纳米粒中含有青蒿素。

9、在药效上，采用本发明提取方法提取的黄花蒿外囊泡可以改变m2样巨噬细胞极化，在肿瘤微环境中，m2样巨噬细胞占肿瘤相关巨噬细胞的大部分，抑制或改变m2样细胞被认为是一种有效的癌症治疗策略；通过实时荧光定量聚合酶链式反应(rt-pcr)和酶联免疫吸附实验elisa进一步确定黄花蒿外囊泡可以改变巨噬细胞的m2样极化。通过试验还验证了黄花蒿外囊泡刺激的巨噬细胞上清液治疗显著增加了a549和llc肺癌细胞的凋亡。通过小鼠体内试验验证了黄花蒿外囊泡治疗显著抑制肿瘤生长，黄花蒿外囊泡治疗小鼠的肿瘤重量减轻了23％；he染色结果表明在各组小鼠的心、肝、脾、肾、肺、脑组织中，黄花蒿外囊泡无明显药物毒性损伤。以上实验结果提示，黄花蒿外囊泡可以改变m2样巨噬细胞极化，调节肿瘤微环境抑制肺癌细胞生长的作用。

10、总之，本发明提供的黄花蒿外囊泡可以改变体内和体外的巨噬细胞极化，增加m1表型巨噬细胞的数量，这有助于抗肿瘤反应。本发明提取的黄花蒿外囊泡作为一种免疫调节剂参与哺乳动物的免疫反应，可作为一类新的纳米药物用于癌症免疫治疗。

技术特征：

1.一种黄花蒿外囊泡的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括步骤：将新鲜黄花蒿整株纯水清洗干净后，再加入纯水研磨得到汁液；将所述汁液依次经过200×g离心10分钟，2000×g离心20分钟，10,000×g离心30分钟，取上清液以去除大颗粒和纤维，将上清液经过100000×g离心处理1h，沉淀悬浮于pbs中；采用蔗糖密度梯度离心法将样品转至15％、30％、45％、60％蔗糖溶液150,000×g离心1h，收集45％蔗糖溶液层，加入与45％蔗糖溶液层等体积等体积的pbs，150,000×g离心1h洗去蔗糖，收集沉淀，后采用无菌pbs重悬，新鲜使用或保存在-80℃，上述离心的离心半径均为39.5mm。

2.权利要求1所述提取方法提取获得的黄花蒿外囊泡提取物，其特征在于，所述黄花蒿外囊泡提取物中含有黄花蒿外囊泡，所述黄花蒿外囊泡为水合粒径为124.8±0.9nm的球形外囊泡样纳米粒，所述球形外囊泡样纳米粒具有负zeta电位值-26.7±0.87mv。

3.权利要求2所述的黄花蒿外囊泡提取物在制备调节免疫微环境药物中的应用。

4.权利要求2所述的黄花蒿外囊泡提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求3或权利要求4中任意一项所述的应用，其特征在于，所述黄花蒿外囊泡为唯一活性成分。

6.权利要求3或权利要求4中任意一项所述的应用，其特征在于，所述黄花蒿外囊泡提取物浓度为20μg/ml。

技术总结
本发明属于植物来源外囊泡提取的技术领域，具体公开了一种黄花蒿外囊泡提取物及其应用，所述黄花蒿外囊泡提取物是从黄花蒿这种天然植物中提取出的含有天然球形外囊泡样纳米粒的提取物，通过从黄花蒿中提取外囊泡，具有成本低，递送效率高且不存在人工纳米载体用于载药制备时的空载问题，提取的外囊泡的其他成分也无毒副作用。黄花蒿外囊泡在调节免疫微环境药物中的应用，将黄花蒿外囊泡作为免疫调节剂，与巨噬细胞共培养使体内外的巨噬细胞由M2样表型向M1表型的极化。

技术研发人员：韩超,王赟,赵雨,胡晓娴,王晓萍
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15