本发明涉及生物，具体涉及一种自环化rna(automatic circulatingrna，acrna)，环状rna及其制备方法。
背景技术：
：：1、环状rna(circular rna，circrna)是一类不具有5'端帽子和3'端polya尾巴，且5'端与3'端以共价健形成环状结构的rna分子。有报道称circrna可参与调节基因转录、mirna活性的中和以及rna结合蛋白的结合，也可作为模板翻译成蛋白质(yang,y.,et al.,“extensive translation of circular rnas driven by n(6)-methyladenosine,”,cellresearch,27(5):626-641(2017)；abe,n.,et al.,“rolling circle translation ofcircular rnain living human cells”,scientific reports,5:16435(2015)；gao,x.,etal.,“circular rna-encoded oncogenic e-cadherin variant promotes glioblastomatumorigenicity through activation of egfr-stat3signalling,”nature cellbiology,23(3):278-291(2021)；pamudurti,nr.,et al.,“translation of circrnas,”molecular cell,66(1):9-21(2017))。与线性rna相比，circrna由于其共价闭合的环状头尾结构不易被rna降解系统识别，具有更强的稳定性。随着rna疫苗的发展，circrna由于其高度的稳定性和简单的生产工艺，已成为核酸药物领域的研究热点。此外，circrna具有调控基因表达的作用，可作为生物传感器，也可作为疾病治疗或诊断的生物标记物，是治疗人类疾病的热门靶点。2、近年来，人们对开发circrna的合成技术越来越感兴趣。排列内含子和外显子法(permuted introns and exons，pie)是目前研究最多、应用最广泛的circrna合成方法。2018年，daneil aderson等人利用改良的pie法证实外源性circrna可在真核细胞中稳定、高效表达蛋白(anderson,d.,et al.,“engineering circular rna for potent andstable translation in eukaryotic cells”,nat commun.2018jul 6；9(1):2629)。然而，由于pie法是通过自发的分子内共价连接反应生成circrna，其反应特点使之也可能发生分子间连接产生副产物，且连接效率低，环化效率不稳定。随着目标rna的长度增长，环化成功率会大幅下降，副产物大量增加。此外，为除去非环化的rna和富集circrna，一般还需要通过rnase r将未环化的rna去除。但是由于环状rna和线性的rna性质接近，很难在分离柱上获得基线分离，加之rnase r常残留对环状rna非特异的降解活性，使得在体外大规模制备环状rna存在很高的成本，且因难以避免的质控副产物和富集步骤带来的降解产物以及额外的rnase r酶残留，环状rna的商业化质控也面临很大挑战。3、除此之外，已有研究通过利用后生动物的trna内含子环化机制，在体外或细胞内合成短小的环状rna适配体(rna aptamer)，有效提高了rna适配体调节蛋白质的功能(litke jl,jaffrey sr.highly efficient expression of circular rna aptamers incells using autocatalytic transcripts.nat biotechnol.2019jun；37(6):667-675.)。该方法可实现短小rna的环化，然而该方法目前只用于短小的rna适配体(broccoli，长度仅49nt)的环化，此外，该方法使用的是果蝇trna的部分序列，特别是该trna的内含子部分，这些非人源化的序列存在一定的潜在安全性风险，比如可能引入额外的免疫原性反应，或干扰细胞内其他内源性rna的正常功能。因此，如何设计出成本更低、高品质和更安全可用于长序列基因表达的环化rna，仍是本领域亟待解决的问题。4、以上提及的文献均以全文引入本文。技术实现思路1、本发明发现，人源trna的有效序列可进行细胞内的自环化，并构建了通用型自环化rna(automatic circulating rna，acrna)的框架模板，可方便的用于制备不同大小的自环化rna。本发明通过利用细胞内天然的trna剪接机制，可以在细胞内进行rna高效的自环化，无需进行体外环化和富集，极大的降低了现有pie等体外环化方法的高成本和纯化难度。同时，由于本发明采用了人源化的trna序列，也降低了潜在的安全性风险。本发明提供的含人源trna部分序列的acrna，还可携带长序列的目的基因片段，可成功用于蛋白质稳定表达、基因编辑，rna编辑等多种应用。2、如本文所用，转运核糖核酸(transfer ribonucleic acid，trna)是一种比较小的rna，成熟的trna一般由74-93个核苷酸构成，其二级结构为四茎三环的三叶草结构，三环即d环、反密码子环和tψc环，四个茎，即d茎(与d环联接的茎)、反密码子茎(与反密码子环联接)、tψc茎(与tψc环联接)和氨基酸接受茎，如图1a所示。trna基因可根据其是否含有内含子分为两类，其中含有内含子的trna基因首先转录出含内含子的trna前体，除了上述茎/环结构外(除尚未形成的反密码子环外)，还含有内含子茎和内含子环(如图1b所示)，在转录出前体trna后的成熟过程中，前体trna(precursor trna，pre-trna)需要经过一系列转录后加工和修饰，去掉内含子部分，形成反密码子环，完成碱基修饰后才能生成成熟的trna。在pre-trna的成熟过程中，至关重要的一步是“trna剪接”，用于除去内含子和把外显子连接起来。剪接后，外显子一侧会形成反密码子环，内含子一侧的内含子茎的游离端也会被连接起来形成一个小的环状rna，如图1b所示。在已知的生物中，原核和真核生物中均发现有一部分trna基因存在内含子，这些内含子序列必须经过trna剪接被精确地去除。目前发现的人类trna基因中，含有内含子的trna根据其反密码子和可携带的氨基酸残基可分为7类：人源trnatyr-gta(seq id no：1～13)、trnatyr-ata(seq id no：14)、trnaile-tat(seqid no：15～19)、trnaarg-tct(seq id no：20～23)、trnaleu-caa(seq id no：24～28)、trnapro-agg(seq id no：29)或trnaphe-gaa(如seq id no：30)。在真核生物中，trna剪接分为“剪”和“接”两个过程：前者负责将pre-trna中的内含子去除，由tsen复合物执行；后者负责将切开的两个外显子连接，由trna连接酶(rtcb)介导。3、一方面，本发明提供一种能够形成自环化rna(acrna)的前体rna(prerna)，前体rna为一种线性rna，从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：4、a:5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件；5、x:具有生物学活性的rna序列；6、d：3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件，7、其中，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件均包含核酶识别序列和人源trna的部分序列，且5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件可以在自剪切核酶或dna核酶的作用下被切割并生成5'-羟基；3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件可以在自剪切核酶或dna核酶的作用下被切割并生成2',3'-环磷酸。特别地，所述核酶识别序列与具有生物学活性的rna序列之间存在至少部分人源trna的序列，例如部分3'端人源trna位于所述5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，或部分5'端人源trna位于所述3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端。8、在一些实施方案中，所述具有生物学活性的rna序列包括但不限于基因编辑中使用的引导rnas(如grna、sgrna、crrna、omegarna和pegrna等)，rna编辑中使用的自招募rna(arrna)，反义rna，干扰rna，微小rna(microrna)，长链非编码rna(lncrna)和自放大rna(sarna)以及编码所需蛋白质如抗原的rna等rna序列中的一种或多种。9、在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于100nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于500nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于1000nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于2000nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于5000nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量大于6000nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于7000nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于8000nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于9000nt。在一些实施方案中，a和d之间x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量大于10000nt。10、在一些实施方案中，x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量为a至b个nt，其中a小于b并且a是1至2000的整数以及b是100至20000的整数，例如a和b独立地选自5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000和20000。例如，x序列的总核苷酸数量或具有生物学活性的rna序列的总核苷酸数量为10-20000、10-15000、10-10000、10-5000、10-2000、10-1500、10-1400、10-1300、10-1200、10-1100、50-20000、50-15000、50-10000、50-5000、50-2000、50-1500、50-1400、50-1300、50-1200、50-1100、100-20000、100-15000、100-10000、100-5000、100-2000、100-1500、100-1400、100-1300、100-1200、100-1100、500-20000、500-15000、500-10000、500-5000、500-2000、500-1500、500-1400、500-1300、500-1200、1000-20000、1000-15000、1000-10000、1000-5000、1000-2000、1000-1500、1000-1400、1000-1300、1000-1200、2000-20000、2000-15000、2000-10000、2000-5000、2000-4000、2000-3000或2000-2500个nt。11、在一些实施方案中，具有生物学活性的rna序列包含或为蛋白编码序列(cds)及内部核糖体进入位点(ires)。具体地，前体rna从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：12、a：5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件；13、b：内部核糖体进入位点(ires)；14、c：蛋白编码区(cds)；15、d：3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件。16、所述5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件可以在自剪切核酶或dna核酶的作用下被切割并生成5'-羟基；所述3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件可以在自剪切核酶或dna核酶的作用下被切割并生成2',3'-环磷酸。17、在一些实施方案中，上述结构域的核苷酸序列之间可包括不同序列的间隔物，或者其中某两个结构域的核苷酸序列之间包括间隔物，以便进一步提高细胞内的稳定性或表达效率。18、进一步地，前体rna为以下结构：19、a-b-c-d20、a、b、c、d结构域按顺序依次连接，上述结构域的b和/或c也可以由其他具有其他生物学功能的序列取代。21、在一些实施方案中，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件和3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的人源trna的部分序列分别选自人源trna的外显子全长/截短序列，且5'端的人源trna的部分序列与3'端的人源trna的部分序列包含人源trna中能够部分互补并至少形成反密码子茎的核苷酸序列。22、在一些实施方案中，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件和3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的人源trna的部分序列分别选自人源trna的内含子序列，且5'端的人源trna的部分序列与3'端的人源trna的部分序列包含人源trna中能够部分互补并形成内含子茎的核苷酸序列。23、在一些实施方案中，3'端和5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件包括人源trna的部分序列和核酶识别序列，优选地人源trna的部分序列至少包含能够在核酶切割后部分互补并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎或内含子茎)序列。除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环或内含子茎的结构均是rtcb连接酶的有效底物。24、在一些实施方案中，基于trna设计的核酶剪接元件为包含外显子中反密码子茎的trna部分序列和核酶识别序列组成。在一些实施方案中，基于trna设计的核酶剪接元件为trna的全部或部分外显子序列(至少含反密码子茎)和核酶识别序列组成。在一些实施方案中，以trna内含子茎和核酶识别序列组成作为trna核酶剪接元件。制备模板质粒时，将目标序列插入上述外显子(至少含反密码子茎)远离反密码子环一侧或内含子茎靠近内含子环一侧。当体外转录生成prerna后，被核酶(rna核酶或另加dna核酶)切割时，切割位点发生在插入目标序列位置的反密码子茎或内含子茎的另一侧，从而产生适合连接的末端，即形成反密码子环的开环末端或远离内含子环的内含子茎的游离末端。接着，在体外或体内rna连接酶(rtcb)的作用下，外显子(至少含反密码子茎)的反密码子环的开环末端侧或内含子茎远离内含子环的游离末端一侧被连接成环。25、如本文所用，基于人源trna设计的核酶剪接元件包含“人源trna的部分序列”或“人源trna序列”是指该元件包含的至少部分核糖核酸碱基序列与天然的人源trna序列的一部分或全部是相同的。需要指出的是，该部分核糖核酸碱基序列与天然的人源trna序列的一部分或全部可以不是100％完全相同。在一些实施方案中，该部分核糖核酸碱基序列可以包含一或多种修饰(例如人源trna序列未包含的修饰)，例如用于提高核酸分子稳定性的修饰，这些修饰是本领域技术人员已知的或者根据技术知识可以合理确定的。在一些实施方案中，该部分核糖核酸碱基序列可以存在部分突变，例如用于提高核酶剪切的活性，这些突变是本领域技术人员已知的或者根据技术知识可以合理确定的。26、如本文所用，“全长外显子”或“外显子全长序列”，指人源trna组成所有外显子茎/环结构的外显子序列。“截短外显子”或“外显子截短序列”，指人源trna外显子中至少能组成反密码子茎，但可以缺失其他trna茎/环的外显子序列。27、如本文所用，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件和3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件包含人源trna的外显子序列，是指该5'端元件包含了人源trna外显子两条序列中的一条的一部分或全部序列，3'端元件包含了人源trna外显子两条序列中的另一条的一部分或全部序列，和在一起涵盖了外显子的全部或部分序列。28、如本文所用，“形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环或内含子茎的结构”中的茎和环是指所述序列根据碱基互补配对原则理论上可以形成人源trna中的茎和/或环，即d茎、反密码子茎、tψc茎、氨基酸接受茎和内含子茎之一，以及d环、反密码子环和tψc环之一。其中，茎至少应包含反密码子茎或内含子茎，在包含反密码子茎的同时，还以添加d茎、tψc茎或氨基酸接受茎的一部分或全部，例如茎一般应至少含3个以上和10个以下配对碱基(如3、4、5、6、7、8、9或10个成对碱基)，也可以添加环，优选是完整的d环、反密码子环或tψc环。29、在一些实施方案中，所述人源trna序列来自含有内含子的人源trnatyr-gta(seqid no：1～13)、trnatyr-ata(seq id no：14)、trnaile-tat(seq id no：15～19)、trnaarg-tct(seq id no：20～23)、trnaleu-caa(seq id no：24～28)、trnapro-agg(seq id no：29)或trnaphe-gaa(如seq id no：30)中的一或多种。30、在一些实施方案中，基于人源trna设计的核酶剪接元件的核酶识别序列包含自剪切rna核酶序列或与dna核酶互补的序列。31、在一些实施方案中，人源trna部分序列为人源trnatyr-gta的全长外显子，核酶识别序列为自剪切rna核酶序列，5'端和3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件自剪切后可部分互补并形成含反密码子茎、d茎、tψc茎、氨基酸接受茎、d环、反密码子环和tψc环。优选地，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的序列如下所示(下划线斜体为trna序列)：32、33、和/或34、3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的序列如下所示(下划线斜体为trna序列)：35、36、在一些实施方案中，人源trna部分序列为人源trnatyr-gta的全长外显子，核酶识别序列为dna核酶互补序列。优选地，5'端核酶剪接元件包含seq id no:33所示的序列，3'端的dna核酶序列包含seq id no:34所示的序列，5'端的dna核酶互补序列对应的dna核酶包含seq id no:35所示的序列，3'端dna核酶互补序列对应的dna核酶包含seq id no:36所示的序列。37、本发明还提供一种自环化rna，所述自环化rna为上述任意所述前体rna剪切后形成的rna，自环化rna的5'端剪切后形成羟基，3'端剪切后形成2',3'-环磷酸。38、在一些实施方案中，自环化rna从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：39、a':5'端形成羟基的人源trna的序列；40、b：内部核糖体进入位点(ires)；41、c：蛋白编码区(cds)；42、d'：3'端形成2',3'-环磷酸的人源trna的序列。43、在一些实施方案中，上述结构域的b和/或c也可以由其他具有生物学功能的序列取代。44、进一步地，该自环化rna为一种线性rna，如下所示，45、46、在一些实施方案中，a'、b、c、d'四个结构域按顺序依次连接，即前体rna的结构为5'羟基-5'端人源trna部分序列-内部核糖体进入位点(ires)-蛋白编码区(cds)-3'端人源trna部分序列-2',3'环磷酸。47、在一些实施方案中，人源trna序列为人源trnatyr-gta的全长外显子，5'端形成羟基的人源trna序列如下所示；48、5'-oh-aaccttaggtcgctggttcaattccggctcgaagg……-3'(seq id no：37)49、3'端形成2',3'-环磷酸的人源trna序列如下所示：50、5'-……ccttcgatagctcagctggtagagcggaggtctgtag-2',3'-环磷酸(seq id no：38)。51、在一些实施方案中，人源trna序列为人源trnatyr-gta的截短外显子，5'端形成羟基的人源trna序列如下所示；52、5'-oh-aacctt……-3'(seq id no：39)53、3'端形成2',3'-环磷酸的人源trna序列如下所示：54、5'-……tagctcagctggtagagcggaggtctgtag-2',3'-环磷酸(seq id no：40)。55、本发明提供的acrna，以人源trna内部的有效序列作为人源trna剪接元件的人源trna序列，不仅免疫原性低，可在细胞内直接自动成环，安全高效，而且可携带长序列的目的基因片段，可成功用于蛋白质稳定表达、基因编辑，rna编辑等多种应用。56、在进一步的实施方案中，5'端人源trna序列与3'端人源trna序列均为同一所述人源trna的部分序列，且5'端人源trna序列与3'端人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补，并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎或内含子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环或内含子茎的结构均是rtcb连接酶的有效底物。57、在进一步的一些实施方案中，5'端和3'端人源trna序列均为同一人源trna的部分序列，且5'端人源trna序列与3'端人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补，并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎或内含子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环或内含子茎的结构均是rtcb连接酶的有效底物。具体的，可以包含能够形成一个或多个人源trna的茎环的序列。58、本发明所说的5'端人源trna序列与3'端人源trna序列可部分互补，是指5'人源trna序列与3'人源trna序列可部分碱基互补配对形成完整或不完整的反密码子茎或内含子茎，在包含反密码子茎的同时，还可以添加d茎、tψc茎或氨基酸接受茎的一部分或全部，例如茎一般应至少含3个以上以及10个以下配对碱基(如3、4、5、6、7、8、9或10个成对碱基)，也可以添加环，优选是完整的d环、反密码子环或tψc环。59、本技术提供的人源trna，为包含内含子的trna。参见图1b、1c，本发明将trna拆分为外显子部分和内含子部分。在一些实施方案中，trna去除内含子后剩余的两条外显子分别作为5'端和3'端的trna序列，内部核糖体进入位点(ires)及蛋白编码区(cds)等目标序列连接在原trna远离反密码子环一侧开放的外显子的两端，原内含子被剪切后留下的开口可以被剪切后形成5'-羟基和2'、3'-环磷酸后通过连接酶连接起来形成反密码子环，进而形成环状rna。在一些实施方案中，trna去除外显子后剩余一条内含子序列，内部核糖体进入位点(ires)及蛋白编码区(cds)等目标序列插入到内含子序列的内含子环一侧，被插入的内含子茎的两条链分别作为5'端和3'端的trna序列，被剪切后获得5'-羟基和2'、3'-环磷酸后通过连接酶连接起来，进而形成环状rna。60、本发明提供的基于核酶设计剪接元件包括5'端人源trna序列或3'端人源trna序列和核酶识别序列，其中，5'人源trna序列与3'人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎或内含子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环或内含子茎的结构均是rtcb连接酶的有效底物。61、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnatyr-gta(seq id no：1～13)、trnatyr-ata(seq id no：14)、trnaile-tat(seq id no：15～19)、trnaarg-tct(seq id no：20～23)、trnaleu-caa(seq id no：24～28)、trnapro-agg(seq id no：29)或trnaphe-gaa(如seqid no：30)中的一或多种。62、在一些进一步的实施方案中，人源trnatyr-gta的外显子或内含子序列部分(seqid no：1～13，大写部分为外显子，小写部分为内含子)被用于设计5'端和3'端的核酶剪接元件。63、在一些进一步的实施方案中，人源trnatyr-ata的外显子或内含子序列部分(seqid no：14，大写部分为外显子，小写部分为内含子)被用于设计5'端和3’端的核酶剪接元件。64、在一些进一步的实施方案中，人源trnaile-tat的外显子或内含子序列部分(seqid no：15～19，大写部分为外显子，小写部分为内含子)被用于设计5'端和3'端的核酶剪接元件。65、在一些进一步的实施方案中，人源trnaarg-tct的外显子或内含子序列部分(seqid no：20～23，大写部分为外显子，小写部分为内含子)被用于设计5'端和3’端的核酶剪接元件。66、在一些进一步的实施方案中，人源trnaleu-caa的外显子或内含子序列部分(seqid no：24～28，大写部分为外显子，小写部分为内含子)被用于设计5'端和3’端的核酶剪接元件。67、在一些进一步的实施方案中，人源trnapro-agg的外显子或内含子序列部分(seqid no：29，大写部分为外显子，小写部分为内含子)被用于设计5'端和3’端的核酶剪接元件。68、在一些进一步的实施方案中，人源trnaphe-gaa的外显子或内含子序列部分(seqid no：30，大写部分为外显子，小写部分为内含子)被用于设计5'端和3’端的核酶剪接元件。69、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnatyr-gta，5'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：70、5'-aaccttaggtcgctggttcaattccggctcgaagg-3'(seq id no：41)，和/或71、3'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：72、5'-ccttcgatagctcagctggtagagcggaggtctgtag-3'(seq id no：42)。73、在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：41序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：42序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：41序列的全部或其中的一部分，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq idno：42序列的全部或其中的一部分，5'端人源trna序列与3'端人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补，并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环的结构均是rtcb连接酶的有效底物。74、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnatyr-gta，5'端核酶剪接元件的人源trna截短外显子序列如下所示：75、5'-aacctt-3'(seq id no：43)，和/或76、3'端核酶剪接元件的人源trna截短外显子序列如下所示：77、5'-tagctcagctggtagagcggaggtctgtag-3'(seq id no：44)。78、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnatyr-gta，5'端人源核酶剪接元件的trna内含子序列如下所示：79、5'-aatgcgga-3'(seq id no：45)，和/或80、3'端核酶剪接元件的人源trna内含子序列如下所示：81、5'-aacgtttttggac-3'(seq id no：46)。82、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnatyr-ata，5'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：83、5'-gtccttaggttgctggttcgattccagcttgaagg-3'(seq id no：47)，和/或84、3'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：85、5'-ccttcaatagttcagctggtagagcagaggactatag-3'(seq id no：48)。86、在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：47序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：48序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：47序列的全部或其中的一部分，3'核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：48序列的全部或其中的一部分，5'人源trna序列与3'人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环的结构均是rtcb连接酶的有效底物。。87、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnaile-tat，5'端核酶剪接元件的人源全长trna全长外显子序列如下所示：88、5'-aagccgaggttgtgagttcaagcctcacctggagca-3'(seq id no：49)，和/或89、3'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：90、5'-gctccagtggcgcaatcggttagcgcgcggttcttata-3'(seq id no：50)。91、在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：49序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：50序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：49序列的全部或其中的一部分，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq idno：50序列的全部或其中的一部分，5'端人源trna序列与3'端人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补，并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环的结构均是rtcb连接酶的有效底物。92、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnapro-agg，5'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：93、5'-aaggagacccaagaggtcccgggttcaaatcccggacgagcc-3'(seq id no：51)，和/或94、3'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：95、5'-ggctcgttggtctaggggtgtggttctcgtttaggg-3'(seq id no：52)。96、在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：51序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，3'端核酶剪接元件的人源trna剪序列为seq idno：52序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：51序列的全部或其中的一部分，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq idno：52序列的全部或其中的一部分，5'端人源trna序列与3'端人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环的结构均是rtcb连接酶的有效底物。97、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnaphe-gaa，5'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：98、5'-aactgcaggtctctggttcaattccgggtttcgac-3'(seq id no：53)，和/或99、3'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子的序列如下所示：100、5'-gccgaaatagctcaattgggagagtgttagtctgaag-3'(seq id no：54)。101、在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：53序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：54序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：53序列的全部或其中的一部分，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq idno：54序列的全部或其中的一部分，5'端核酶剪接元件的人源trna序列与3'核酶剪接元件的人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环的结构均是rtcb连接酶的有效底物。102、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnaleu-caa，5'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：103、5'-aactggtctccgtatggaggcgtgggttcgaatcccacttctgaca-3'(seq id no：55)，和/或104、3'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：105、5'-gtcaggatggccgagtggtctaaggcgccagtctcaag-3'(seq id no：56)。106、在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：55序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：56序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：55序列的全部或其中的一部分，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq idno：56序列的全部或其中的一部分，5'人源trna序列与3'人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环的结构均是rtcb连接酶的有效底物。107、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnaarg-tct，5'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：108、5'-aatcaaaggttgtgggttcgagtcccaccagagtcg-3'(seq id no：57)，和/或109、3'端核酶剪接元件的人源trna全长外显子序列如下所示：110、5'-ggctctgtggcgcaatggatagcgcattggtcttcta-3'(seq id no：58)。111、在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：57序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：58序列的全部或其中的一部分。在一些实施方案中，5'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq id no：57序列的全部或其中的一部分，3'端核酶剪接元件的人源trna序列为seq idno：58序列的全部或其中的一部分，5'人源trna序列与3'人源trna序列至少包含能够在核酶切割后部分互补并形成含内含子的人源trna剪接位点处特有的末端局部双链rna(反密码子茎)序列，除此之外，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的3’端，和/或3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的5’端，也可以含有(或不含)额外的所述人源trna的其他茎或环结构。所形成的trna剪接位点末端的反密码子茎或反密码子茎+其他茎+环的结构均是rtcb连接酶的有效底物。112、本发明还提供一种用于产生前体rna的核酸载体，所述载体包含上述任一所述的环状rna前体的编码序列。113、本发明还提供一种用于产生环状rna的前体rna的核酸载体，所述载体的序列按顺序包括以下元素的编码序列：114、t7启动子-5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件-内部核糖体进入位点(ires)-蛋白编码区(cds)-3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件-线性化酶切位点序列。115、在一些进一步的实施方案中，5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件与3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件均包括人源trna序列及核酶识别序列，5'端人源trna序列与3'人源trna序列均为同一人源trna的部分序列，且5'端人源trna序列与3'人源trna序列可部分互补并能够形成至少一个所述人源trna的茎环。116、在一些进一步的实施方案中，人源trna为人源trnatyr-gta(seq id no：1～13)、trnatyr-ata(seq id no：14)、trnaile-tat(seq id no：15～19)、trnaarg-tct(seq id no：20～23)、trnaleu-caa(seq id no：24～28)、trnapro-agg(seq id no：29)或trnaphe-gaa(如seqid no：30)中的一或多种。117、在一些进一步的实施方案中，核酶识别序列为编码自剪切核酶的序列。本文所述自剪切核酶为能自剪切并生成5'端羟基和3'端2',3'-环磷酸结构的核酶。在一些实施方案中，自剪切核酶可以包括rna酶p、rrna、引导酶(leadzyme)、i组内含子核酶、ii组内含子核酶、gir1分支核酶、glms核酶、发夹核酶(hairpin ribozyme)、锤头状核酶(hammerheadribozyme)、hdv核酶、绕线核酶(twister ribozyme)、绕线姐妹核酶(twister sisterribozyme)、vs核酶、手枪核酶(pistol ribozyme)、手斧核酶(hatchet ribozyme)、类病毒中的一种或两种。118、在一些实施方案中，核酶识别序列为与dna核酶互补并可被dna核酶靶向识别和定点切割的序列。本文所述dna核酶为能识别特异rna序列并切割rna生成5'端羟基和3'端2',3'-环磷酸结构的dna核酶。在一些实施方案中，dna核酶为10-23dna核酶、8-17dna核酶、17edna核酶、ac07 dna核酶、ac14 dna核酶、ac17 dna核酶中的一种或两种。119、在一些进一步的实施方案中，dna核酶为10-23dna核酶。120、另一方面，本发明还提供一种环状rna，其中，环状rna为上述任意一项所述自环化rna在rna连接酶的存在下自环化形成的环状rna。121、在一些进一步的实施方案中，环状rna包含以下结构域：122、a”：5'端人源trna序列；123、b：内部核糖体进入位点(ires)；124、c：蛋白编码区(cds)；和125、d”：3'端人源trna序列；126、其中，5'端人源trna序列与3'端人源trna序列共价连接。127、在一些进一步的实施方案中，5'端人源trna序列与3'端人源trna序列均为同一人源trna的部分序列，且5'端人源trna序列与3'端人源trna序列包含或为可部分互补并能够形成至少一个人源trna的反密码子茎或内含子茎的核苷酸序列。128、在一些进一步的实施方案中，人源trna的序列选自含有内含子的trnatyr-gta(seqid no：1～13)、trnatyr-ata(seq id no：14)、trnaile-tat(seq id no：15～19)、trnaarg-tct(seq id no：20～23)、trnaleu-caa(seq id no：24～28)、trnapro-agg(seq id no：29)或trnaphe-gaa(如seq id no：30)中的一或多种。129、另一方面，本发明还提供一种环状rna的制备方法，该方法包含:130、(1)提供上述任一的核酸载体，经线性化后体外转录得到线性的前体rna；131、(2)体外转录过程中通过核酶自剪切或dna核酶剪切作用，得到含有5'端羟基和3'端2'，3'-环磷酸结构的所述自环化rna；132、(3)自环化rna在rna连接酶的作用下发生共价结合作用，形成环状rna。133、在一些实施方案中，核酶识别序列设置为自剪切核酶的序列，如twisterribozyme，其在核酸载体转转录过程中发生自剪切，直接形成含有5'端羟基和3'端2'，3'-环磷酸的前体rna。在一些实施方案中，核酶识别序列设置为与dna核酶互补的序列，体外转录成初始rna后采用dna核酶进行靶向切割，切割位点置于5'端人源trna剪接元件首端与3'端人源trna剪接元件的末端，得到含有5'端羟基和3'端2'，3'-环磷酸的自环化rna。134、在一些实施方案中，提供一种连接酶，可以将5'端羟基和3'端2'，3'-环磷酸结合起来，具体的，连接酶可以是rtcb。在一些实施方案中，将acrna转染至细胞内，转染方法可以选择，例如脂质体转染、钙转、pei转染或电转，本实施例中优选pei转染，细胞内部存在天然的rna连接酶，acrna在细胞内部自动生成环状rna。135、另一方面，本发明还提供一种重组生产目标蛋白的方法，包括：136、制备本发明所述的自环化rna或环状rna，其中自环化rna或环状rna中的蛋白编码区为编码所述目标蛋白的核酸序列；137、将所述自环化rna或环状rna引入宿主细胞，例如通过转染，特别是通过使用pei的转染方法，138、在宿主细胞中表达所述感兴趣的蛋白；以及139、任选地，分离和/或纯化所表达的感兴趣的蛋白。140、在一些实施方案中，所述宿主细胞可以是人和非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、羊、牛、马)的原代细胞或细胞系，例如包括但不限于cho、hela、293细胞。141、在一些实施方案中，所述环状rna如下制备：提供本发明所述的核酸载体，经线性化后，体外转录得到线性的前体rna；体外转录过程中通过rna核酶自剪切或体外转录后通过dna核酶剪切作用，得到含有5'-羟基和2',3'-环磷酸的自环化rna；以及所述自环化rna在体外在rna连接酶的作用下，两端发生共价结合作用，形成所述环状rna，或者将所述自环化rna引入(例如通过转染，特别是通过使用pei的转染方法)宿主细胞，在宿主细胞内存在的天然的rna连接酶作用下，在细胞内自动环化生成环状rna。142、另一方面，本发明还提供制备rna疫苗的方法，包括：制备本发明所述的环状rna，其中环状rna中的蛋白编码区为编码目标免疫原的核酸序列。143、在一些实施方案中，所述环状rna如下制备：提供本发明所述的核酸载体，经线性化后，体外转录得到线性的前体rna；体外转录过程中通过rna核酶自剪切或体外转录后通过dna核酶剪切作用，得到含有5'-羟基和2',3'-环磷酸的自环化rna；以及所述自环化rna在rna连接酶的作用下，两端发生共价结合作用，形成所述环状rna。144、另一方面，本发明还提供本发明所述的环状rna用于制备rna疫苗的用途，其中环状rna中的蛋白编码区为编码感兴趣的免疫原的核酸序列。145、另一方面，本发明还提供一种在对象中治疗疾病或免疫接种的方法，包括：制备本发明所述的自环化rna或环状rna，其中自环化rna或环状rna中的蛋白编码区为编码目标治疗蛋白或免疫原的核酸序列，将所述自环化rna或环状rna给有需要的对象施用，从而在所述对象中表达所述治疗蛋白或免疫原。146、在一些实施方案中，所述对象是人和非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、羊、牛、马，优选人。147、本发明通过人源trna的有效序列作为剪接元件的一部分，可进行细胞内的自环化，并构建了通用型自环化rna(automatic circulating rna，acrna)的框架模板，可方便的用于制备不同大小的自环化rna。本发明通过利用细胞内天然的trna剪接机制，不仅可以通过内源性rna连接酶在细胞内进行rna高效的自环化，无需进行体外环化和富集，极大的降低了现有pie方法的高成本和纯化难度，还降低了潜在的安全性风险，还可携带长序列的目的基因片段，能够成功用于蛋白质稳定表达、基因编辑，rna编辑等多种应用。当前第1页12当前第1页12