一种地衣芽孢杆菌活性代谢产物的制备方法与流程

本发明属于微生物，涉及一种地衣芽孢杆菌活性代谢产物的制备方法。

背景技术：

1、金山醋酸乳杆菌(acetilactobacillusjinshanensis)属于乳杆菌科(lactobacillaceae)醋酸乳杆菌属(acetilactobacillus)，是首先从传统食醋发酵醋醅中分离获得的。由于乳杆菌属(lactobacillus)包含超过250个种且它们在表型、生态和基因型水平上呈现多样化，科研人员应用全基因组分析来分析每一个乳酸杆菌物种，将乳酸杆菌属拓展为包含23个新属的25个属，而醋酸乳杆菌属由于系统发育分析结果表明其与乳杆菌属微生物存在显著差异，形成了一个单独谱系而作为新属被划分，金山醋酸乳杆菌是其模式种与唯一种。[1-4]

2、由于金山醋酸乳杆菌的生长条件为20℃-40℃(最适35℃)，ph3.0-5.0(最适4.0)，0％-5％氯化钠浓度(最适0％)，有氧/厌氧/微需氧环境，与我国白酒传统酿造过程酸性厌氧的多菌种群体微生物发酵体系吻合，因此其广泛分布于我国传统白酒固态法酿造过程中并占有较高丰度。目前已知金山醋酸乳杆菌在芝麻香型白酒酿造过程中平均相对丰度占比超过10％；在浓香型白酒的30年窖池发酵70天的酒醅微生物中相对丰度占比达38％，为浓香型白酒发酵后期的主要属。根据需求调控多菌种群体微生物发酵体系中的关键微生物对发酵过程控制十分重要，在发明人所进行的前期工作中，发现常见的抑菌物质(如乳酸链球菌肽)对金山醋酸乳杆菌的调控能力不佳。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种大曲内源性地衣芽孢杆菌活性代谢产物的制备方法，具体是开发液态发酵与真空喷雾干燥技术制备该菌株的液体以及干粉抑菌剂的方法。通过本发明所提供的制备方法制备得到的地衣芽孢杆菌活性代谢产物可以特异性对金山醋酸乳杆菌的生长进行合理调控，且本发明通过优化发酵条件与干燥制粉工艺也进一步提高了该干粉调控剂的制备效率，使其方便大规模制备及保存。

2、中国专利文献cn 105713929 a公开了一种利用nisin发酵废菌体抑制乙醇发酵过程中乳酸菌生长的方法，文献中利用nisin废菌体加入到玉米乙醇发酵中，减少乳酸菌杂菌污染。在所述技术方案中，抗菌物质为nisin(乳酸链球菌肽之一)，添加形式为乳酸链球菌废菌体，抑菌目标为乳酸杆菌(属)。但是本技术发明人经研究发现，nisin(乳酸链球菌肽)对醋酸乳杆菌属的金山醋酸乳杆菌的抑制效力仅约为16％，对其他乳酸杆菌属的如面包乳杆菌与耐酸乳杆菌的抑制效力则可达46％与60％。即，常见的对乳酸杆菌属的乳酸杆菌具有较好抑菌能力的抑菌物质(如乳酸链球菌肽)却对金山醋酸乳杆菌等的抑菌能力却不佳。

3、一方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌活性代谢产物，所述地衣芽孢杆菌活性代谢产物用于调控和/或抑制醋酸乳杆菌属的所有菌、面包乳杆菌、耐酸乳杆菌中的任意一种或者多种菌的生长和/或代谢。

4、在一些实施方案中，所述地衣芽孢杆菌活性代谢产物用于调控和/或抑制醋酸乳杆菌属的任意一种或者多种菌的生长和/或代谢；优选地，所述地衣芽孢杆菌活性代谢产物用于调控和/或抑制金山醋酸乳杆菌的生长和/或代谢。

5、另一方面，本发明还提供了一种地衣芽孢杆菌活性代谢产物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

6、(1)配制发酵培养基；

7、(2)将地衣芽孢杆菌种子液接种至所述发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵培养液；

8、(3)将所述发酵培养液进行离心，取上清液过滤，得到上清液，即为所述代谢产物；

9、其中，所述发酵培养基是以小麦为主要原料配制得到；所述发酵培养基包括如下组分：80-120g/l小麦粉、5-15g/l淀粉酶、5-15g/l糖化酶，余量为去离子水；

10、所述发酵培养包括：在发酵培养开始后的第14-20h中的任意时刻或/当所述发酵培养基中的残糖含量低于8-11g/l时，向所述发酵培养基中进行补料；优选地，所述发酵培养包括：在发酵培养开始后的第14-20h中的任意时刻或/当所述发酵培养基中的残糖含量低于10g/l时，向所述发酵培养基中进行补料。

11、在一些实施方案中，所述发酵培养基的初始糖度为2°bx-6°bx；优选地，所述发酵培养基的初始糖度为3°bx-6°bx；优选地，所述发酵培养基的初始糖度为4°bx-6°bx。

12、在一些实施方案中，所述发酵培养基的ph为5-9；优选地，所述发酵培养基的ph为6-8。

13、在一些实施方案中，所述发酵培养基包括如下组分：90-110g/l小麦粉、8-12g/l淀粉酶、8-12g/l糖化酶，余量去离子水。

14、在一些实施方案中，所述发酵培养基通过如下步骤进行制备：

15、1)将所述小麦粉、淀粉酶按比例加入去离子水中，进行糊化；该步骤中，所述淀粉酶的添加量为淀粉酶总用量的1/3-3/5；

16、2)冷却后，向糊化后的培养基中加入剩余量的淀粉酶、以及糖化酶，进行液化和糖化；

17、3)对糖化后的培养基的糖度进行调节，灭菌后，进行ph调节，得到所述发酵培养基。

18、在一些实施方案中，所述糊化条件为：于100-110℃糊化0.8-1.2h。

19、在一些实施方案中，所述冷却为：冷却至35-45℃。

20、在一些实施方案中，所述液化和糖化的条件为：于35-40℃进行液化和糖化10-15h。

21、在一些实施方案中，所述对糖化后的培养基的糖度进行调节包括：向所述培养基中加水进行稀释调节。

22、在一些实施方案中，所述对灭菌后的培养基进行ph调节包括：利用碳酸钠对所述培养基的ph进行调节。

23、在一些实施方案中，所述灭菌包括：100-120℃高压下蒸汽灭菌15-25min。

24、在一些实施方案中，所述发酵培养基通过如下步骤进行制备：将所述小麦粉与淀粉酶、糖化酶，溶解于去离子水中，于35-40℃条件下，静置3-5h，110-120℃高压下蒸汽灭菌15-30min；优选地，所述发酵培养基通过如下步骤进行制备：将所述小麦粉与淀粉酶、糖化酶，溶解于去离子水中，于36-39℃条件下，静置3-5h，113-118℃高压下蒸汽灭菌18-22min。

25、在一些实施方案中，所述淀粉酶的酶活力为45,000-55000u/g；所述糖化酶的酶活力为45,000-55000u/g；优选地，所述淀粉酶的酶活力为48,000-51000u/g；所述糖化酶的酶活力为48,000-51000u/g。

26、在一些实施方案中，所述步骤(3)中，所述离心条件为：8000-12000r/min，离心5-15min。

27、在一些实施方案中，所述过滤为：通过0.22μm微孔滤膜进行过滤。

28、在一些实施方案中，所述种子液的接种量为1-4％；优选地，所述种子液的接种量为2.5-3.5％。

29、在一些实施方案中，所述种子液的制备方法包括：从地衣芽孢杆菌mx8平板上挑取单菌落，使用ypd培养基进行培养；优选地，所述培养的条件为：35-40℃，培养20-30h；优选地，所述培养的条件为：35-40℃，培养至od600达到0.6-0.8。

30、在一些实施方案中，所述发酵培养的条件：发酵温度为32-40℃，转速为180-220rpm，发酵时间为8-24h；优选地，所述发酵温度33-35℃，转速为200-220rpm，发酵时间为8-24h。

31、在一些实施方案中，在摇瓶水平进行发酵时，所述发酵条件为：发酵时间为16-24h，转速为180-220rpm。

32、在一些实施方案中，在发酵罐水平进行发酵时，所述发酵条件为：发酵温度33-35℃，通气量0.5-2vvm，do关联转速150-500r/min，溶氧设置为20-40％，罐压0.02-0.05mpa，发酵时间为8-10h；优选地，在发酵罐水平进行发酵时，所述发酵条件为：发酵温度33-35℃，通气量0.5-2vvm，do关联转速150-500r/min，溶氧设置为28-35％，罐压0.02-0.05mpa，发酵时间为8-10h。

33、在一些实施方案中，所述补料的方式包括：向所述发酵培养基中，流加未稀释的所述发酵培养基，将发酵体系的糖度调整为1.5-3°bx或/向所述发酵培养基中，流加未稀释的所述发酵培养基，将发酵体系的糖含量调整为18-25g/l；优选地，所述补料的方式包括：向所述发酵培养基中，流加未稀释的所述发酵培养基，将发酵体系的糖度调整为1.5-2.5°bx或/向所述发酵培养基中，流加未稀释的所述发酵培养基，将发酵体系的糖含量调整为18-22g/l。

34、在一些实施方案中，所述流加包括：以500-1500ml/h的恒速进行流加；优选地，所述流加包括：以800-1200ml/h的恒速进行流加。

35、在一些实施方案中，所述未稀释的所述发酵培养基的流加量为发酵体系体积的10-17％；优选地，所述未稀释的所述发酵培养基的流加量为发酵体系体积的12-15％。

36、在一些实施方案中，所述未稀释的发酵培养基的糖度为8-15°bx；优选地，所述未稀释的发酵培养基的糖度为10-13°bx。

37、再另一方面，本发明还提供了一种干粉制剂的制备方法，所述制备方法包括：

38、步骤一，将具有调控和/或抑制效果的菌株进行发酵培养，得到菌株发酵液；

39、步骤二，先取部分所述发酵液与干燥辅料进行混合，进行真空喷雾干燥，在所述真空喷雾干燥的设备罐壁上形成干燥粉壁；

40、步骤三，再将需要制备成干粉的所述发酵液与干燥辅料进行混合，进行真空喷雾干燥，得到所述干粉制剂；

41、所述步骤一中，所述干燥辅料的添加量为所述上清液重量的21％-30％；所述步骤二中，所述干燥辅料的添加量为所述上清液重量的8-20％。

42、在一些实施方案中，所述菌株发酵液为：将所述菌株进行发酵培养得到的发酵培养液经离心处理后的上清液。

43、在一些实施方案中，所述离心条件为5000-12000r/min离心15-25min；优选地，所述离心条件为6000-10000r/min离心16-22min。

44、在一些实施方案中，所述菌株为地衣芽孢杆菌。

45、在一些实施方案中，所述菌株进行调控和/或抑制的目标菌株包括醋酸乳杆菌属的所有菌、面包乳杆菌、耐酸乳杆菌中的任意一种或者多种。

46、在一些实施方案中，所述目标菌株包括金山醋酸乳杆菌、面包乳杆菌、耐酸乳杆菌中的任意一种或者多种。

47、在一些实施方案中，所述干燥辅料为大曲曲粉；优选地，所述大曲曲粉为过75-85目滤网，120-150℃高温灭菌15-25min后得到。

48、在一些实施方案中，所述步骤一中的所述发酵液为通过所述的制备方法制备得到的活性代谢产物。

49、在一些实施方案中，所述步骤二中，所述真空喷雾干燥的条件为：进风温度为65-75℃，出风温度为55-65℃，蠕动泵速度为10-20ml/min，真空度为-0.01--0.05mpa；优选地，所述真空喷雾干燥的条件为：进风温度为68-72℃，出风温度为58-62℃，蠕动泵速度为12-18ml/min，真空度为-0.02--0.04mpa。

50、在一些实施方案中，所述步骤二中，所述发酵液的用量为50-400ml；优选地，所述步骤二中，所述发酵液的用量为100-300ml；优选地，所述步骤二中，所述发酵液的用量为150-250ml；优选地，所述步骤二中，所述发酵液的用量为180-220ml。

51、在一些实施方案中，所述步骤三中，所述真空喷雾干燥的条件为：进风温度为65-75℃，出风温度为55-65℃，蠕动泵速度为25-35ml/min，真空度为-0.01--0.05mpa；优选地，所述真空喷雾干燥的条件为：进风温度为68-72℃，出风温度为58-62℃，蠕动泵速度为28-34ml/min，真空度为-0.02--0.04mpa。

52、再另一方面，本发明还提供了一种通过所述的制备方法制备得到的地衣芽孢杆菌活性代谢产物和/或通过所述的制备方法制备得到的干粉制剂。

53、再另一方面，本发明还提供了一种所述的地衣芽孢杆菌活性代谢产物和/或所述的干粉制剂在酿酒领域的应用。

54、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

55、(1)在本发明技术方案前期的探索过程中发现，使用常规的lb细菌培养基对地衣芽孢杆菌进行培养，会导致地衣芽孢杆菌对金山醋酸乳杆菌的抑制力几乎丧失，甚至没有。基于此，本发明对地衣芽孢杆菌菌株的发酵培养条件进行改进，而基于本发明所改进的发酵培养条件对地衣芽孢杆菌进行培养，大大提升了地衣芽孢杆菌菌株对目标菌的抑制力，正如实施例中，基于改进的发酵条件，地衣芽孢杆菌菌株在摇瓶水平液态发酵22h获得的发酵液对金山醋酸乳杆菌抑制力可高达60.80％，地衣芽孢杆菌菌株在发酵罐水平液态发酵8h获得的发酵液对金山醋酸乳杆菌抑制力可达50.22％，而市售的乳酸链球菌肽(2mg/ml)对金山醋酸乳杆菌抑制力仅为15.90％，即通过所提供的方法制备得到的地衣芽孢杆菌发酵液，具有显著更好的抑制效果。

56、(2)对于本发明所提供的地衣芽孢杆菌活性代谢产物对金山醋酸乳杆菌具有较高抑制力，所用地衣芽孢杆菌筛选自制酒生产，且发酵培养所用的培养基原料也与酿酒过程所使用的原料，如小麦、大曲粉末、淀粉酶、糖化酶等相同，采用本发明所提供的地衣芽孢杆菌活性代谢产物用于调控酿酒过程中金山醋酸乳杆菌的生长，不会向酿造环境中引入其他物质，对酿造环境造成影响。

57、(3)本发明经前期研究探索发现，采用现有技术公开的如真空干燥、冷冻干燥等干燥技术均不能较好的实现对干粉制剂的制备。基于此，本发明对地衣芽孢杆菌活性代谢产物干粉制剂的制备工艺进行改进，基于本发明所改进的制备工艺对干粉制剂进行制备，解决了含糖发酵液带来的粘壁现象，也明显降低了地衣芽孢杆菌mx8干粉制剂干燥制备过程的抑制力损失，也正如实施例部分的数据，通过本发明所提供的干粉制备工艺，地衣芽孢杆菌mx8活性代谢产物干粉制剂在干燥制备过程的抑制力回收率可达88.66％。