m6A去甲基化酶相关基因的siRNA及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及m6a去甲基化酶相关基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用。

背景技术：

1、m6a(6-甲基腺嘌呤，n6-methyladenosine)甲基化，即在rna腺苷酸(a)第六位的n上发生甲基化修饰，是真核生物rna中最常见的一种转录后修饰，约占rna甲基化修饰的80％左右。

2、m6a rna甲基化是一个动态可逆的修饰过程，该过程需要在m6a甲基转移酶复合物(编码器，writers)、m6a去甲基化酶(消码器，erasers)和m6a读取蛋白(读码器，readers)的参与下催化形成。

3、目前鉴定出的两种独立的m6a去甲基化酶：脂肪肥胖相关蛋白(fto)和人源alkb双加氧酶蛋白家族成员alkb同系物5(alkbh5)。

4、研究发现fto在体内诱导rna上m6a去甲基化，证明了m6a修饰的动态可逆。最近还发现fto对n6，2′-o-二甲基腺嘌呤(m6am)修饰也具有去甲基化酶活性，表明fto可能在多种底物上发挥作用。

5、alkbh5较fto的去甲基化活性相当，但不同于fto的氧化去甲基化，alkbh5是以序列特异性优先选择m6a修饰发挥作用，直接催化m6a到a。alkbh5基因缺失会导致细胞质中mrna的全面减少，提示其可能参与到mrna的出核转运中。

6、m6a甲基化修饰主要在mrna前体的剪接、3’端加工、核输出、翻译调节、mrna衰变、mrna的稳定性、环状rna翻译和mirna加工等多个过程中发挥作用，其动态可逆的变化控制对细胞的生长和分化具有重要的调节作用，使得m6a及修饰蛋白的异常在多种重大疾病的发生过程中扮演重要角色。例如，抑制fto的去甲基化酶活性可以降低srebf1、chrebp以及脂肪生成基因的表达,从而改善小鼠脂肪肝中tg的积累；alkbh5在癌症中表达上调,并在胶质母细胞瘤、急性髓性白血病、胃癌、乳腺癌和卵巢癌中作为m6a去甲基化酶发挥致癌作用。然而目前并没有针对m6a去甲基化酶的靶向治疗药物，因此，开发针对m6a去甲基化酶相关基因靶点的药物尤为迫切。

7、sirna(小干扰rna)是一段与靶基因序列同源的、长度在20-25nt的双链rna，可以特异性地引起具有相同序列的mrna的降解，从而阻断相应基因的表达，进而治疗该基因引起的各类疾病。

8、现有的技术中，目前并没有针对m6a去甲基化酶的靶向治疗药物。本发明针对m6a去甲基化酶相关基因设计sirna并有效干扰基因表达，有望突破m6a去甲基化酶相关基因引起的疾病治疗方面的瓶颈。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供m6a去甲基化酶相关基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用，其针对sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含fto及alkbh5在内的去甲基化酶的表达，抑制其生物学功能的发挥。

2、本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

3、m6a去甲基化酶相关基因的sirna，包含fto及alkbh5在内的去甲基化酶的sirna寡聚核酸组合。

4、作为本发明的进一步的技术方案：所述sirna为一种核酸分子，包括gp-fto-1、gp-fto-9、gp-fto-10、gp-alkbh5-1、gp-alkbh5-2、gp-alkbh5-5、gp-alkbh5-6。

5、作为本发明的进一步的技术方案：所述核酸分子为双链rna分子。

6、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-fto-1由如下序列的正义链和反义链组成：

7、正义链：5’-guggcaguguacaguuauatt-3’，

8、反义链：5’-uauaacuguacacugccactt-3’。

9、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-fto-9由如下序列的正义链和反义链组成：

10、正义链：5’-cccaagaaaucgugagaautt-3’，

11、反义链：5’-auucucacgauuucuugggtt-3’。

12、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-fto-10由如下序列的正义链和反义链组成：

13、正义链：5’-guggcaguguacaguuauatt-3’，

14、反义链：5’-uauaacuguacacugccactt-3’。

15、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-alkbh5-1由如下序列的正义链和反义链组成：

16、正义链：5’-ggacuucauucaugcuaautt-3’，

17、反义链：5’-auuagcaugaaugaagucctt-3’。

18、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-alkbh5-2由如下序列的正义链和反义链组成：

19、正义链：5’-agauaaggaaugagugauatt-3’，

20、反义链：5’-uaucacucauuccuuaucutt-3’。

21、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-alkbh5-5由如下序列的正义链和反义链组成：

22、正义链：5’-gggaugauauuaugaaguutt-3’，

23、反义链：5’-aacuucauaauaucauccctt-3’。

24、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-alkbh5-6由如下序列的正义链和反义链组成：

25、正义链：5’-gugaacuggaacagacuaatt-3’，

26、反义链：5’-uuagucuguuccaguucactt-3’。

27、如上述的m6a去甲基化酶相关基因的sirna在疾病治疗方面的应用。

28、如上述的m6a去甲基化酶相关基因的sirna的检测试剂盒，其特征在于，包含fto、alkbh5的引物。

29、作为本发明的进一步的技术方案：所述fto由如下序列的上游引物和下游引物组成：

30、上游引物：5’-tggcagagtgctcaacagg-3’，

31、下游引物：5’-caggctcaaaggatttcaaagag-3’。

32、作为本发明的进一步的技术方案：所述alkbh5由如下序列的上游引物和下游引物组成：

33、上游引物：5’-tcaagcctattcgggtgtcg-3’，

34、下游引物：5’-agcagcatatccactgagca-3’。

35、如上述的m6a去甲基化酶相关基因的sirna在检测试剂盒方面的应用。

36、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

37、本发明公开了一种m6a去甲基化酶相关基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用，其针对sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含fto及alkbh5在内的去甲基化酶的表达，抑制其生物学功能的发挥。