基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法

本发明一种属于基因检测及生物传感器检测方法，具体涉及基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法。

背景技术：

1、microrna(mirna)是一种内源性、高度保守的、短的(长度为18-22个核苷酸)、非编码单链rna，参与转录后基因表达调控。mirna相关的单核苷酸多态性(mirna-snps)包括mirna中特定位点单碱基替换、插入与缺失，对mirna的表达、mirna与信使rna间的相互作用产生重要影响。由于mirna参与调控人类基因组中30％以上的蛋白质编码基因，mirna所发生的微小变异可能对数千条细胞通路产生不可估量的影响，导致基因表达紊乱、多种功能障碍，进而诱发多种疾病与癌症。因此，对人体组织中mirna-snps进行精确定量对临床肿瘤学发展具有重要意义。

2、然而，识别单核苷酸差异的高难度、mirna的序列同源性和小尺寸特性、以及mirna-snps在人体内的低丰度表达等问题对mirna-snps简单、灵敏、特异的定量构成挑战。rna测序是筛选mirna-snps的经典技术之一，但大量的样本消耗、繁琐的程序以及欠佳的灵敏度阻碍其广泛应用。聚合酶链式反应作为传统扩增方法而备受关注，然而严格的操作程序和复杂的实验参数增加了其对操作人员的要求及设备依赖性。因此，迫切需要开发出一种简单、灵敏、低成本的mirna-snps准确定量的生物传感新策略。

3、杂交链式反应作为一种等温核酸扩增技术，因其无酶、高效、成本低、结构灵活等诸多优势，深受科学家们的青睐，被广泛应用于生物传感器的构建中。遗憾的是，目前并没有将杂交链式反应应用到mirna-snps检测中的研究。因此，利用杂交链式反应构建mirna-snps的传感策略，有望为资源匮乏地区的疾病监测、现场检测提供新方案。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的在于针对现有mirna-snps检测技术存在的问题，选择非小细胞肺癌潜在生物标志物mir-196a2t作为检测目标物，开发一种基于杂交链式反应的等温核酸扩增方法构建mirna-snps的荧光生物传感器，灵敏度高、简单易操作、快速、低成本、减少对酶及变温设备的依赖性。

2、技术方案：本发明所述的基于杂交链式反应的mirna-snps超灵敏荧光传感方法，包括三个步骤：连接反应、消化反应、杂交链式反应。

3、基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，所述荧光传感方法包括连接反应、消化反应、杂交链式反应三个步骤：

4、(1)连接反应，杂交链式反应激发链(ab链)的生成：将待测mirna样品加入到连接反应体系中，通过碱基互补配对原理以及splintr连接酶的作用，在35～39℃下进行连接反应，生成mirna互补的dna链，即ab链；优选地，在37℃下进行连接反应；

5、(2)消化反应，步骤(1)所生成的mirna-ab链复合物中mirna的消化：将消化反应缓冲液稀释的rnase h酶加入到步骤(1)反应液中，35～39℃下反应5～30min，使rnase h酶特异性降解mirna-ab链复合物中的mirna，保留ab链；优选地，在37℃下反应5～30min；

6、(3)杂交链式反应，步骤(2)消化保留的ab链激发杂交链式反应：将经退火程序处理的荧光发夹h1和荧光发夹h2加入到步骤(2)反应液中，在16～37℃下孵育0.5～4h，使得激发链ab打开荧光发夹h1，h1所暴露的部分进一步打开荧光发夹h2，h2所暴露的部分再进一步打开荧光发夹h1，进而生成不同长度的dna双链。其中，荧光发夹h1中的fam荧光基团与荧光发夹h2中的tamra荧光基团相互靠近，发生荧光共振能量转移。

7、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(1)中，所述连接反应体系由a链、b链、splintr连接酶、连接反应缓冲液组成；在35～39℃下孵育5～30min，splintr连接酶连接a链与b链的相邻接头，生成ab链；其中，连接反应缓冲液含有tris-hcl、mgcl2、atp、dtt，ph7.0～8.0；a链的dna序列为：gtaactcag；所述b链的dna序列为：*acagtttcttgt，其中*代表的是磷酸基团修饰；所述ab链的dna序列为：gtaactcagacagtttcttgt。优选地，在37℃下进行连接反应；连接反应缓冲液ph7.5。

8、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(2)中，所述消化反应缓冲液含有tris-hcl、kcl、mgcl2、dtt，ph7.3～9.3。优选地，消化反应缓冲液ph8.3。

9、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(3)中，所述退火程序优选为95℃，10min+92.5℃，2min+90.0℃，2min+87.5℃，2min+85.0℃，2min+82.5℃，2min+80.0℃，2min+77.5℃，2min+75.0℃，2min+72.5℃，2min+70.0℃，2min+67.5℃，2min+65.0℃，2min+62.5℃，2min+60.0℃，2min+57.5℃，2min+55.0℃，2min+52.5℃，2min+50.0℃，2min+47.5℃，2min+45.0℃，2min+42.5℃，2min+40.0℃，2min+37.5℃，2min+35.0℃，2min+32.5℃，2min+30.0℃，2min+27.5℃，2min+25.0℃，2min，退火完成后将发夹置于4℃保存。

10、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(3)中，所述荧光发夹h1的dna序列为：agaaactgtctgagttacgttcttgt(fam)aactcagaca；

11、荧光发夹h2的dna序列为：

12、gtaactcagacagtttcttgtct(tamra)gagttacaagaac。

13、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。

14、所述的应用，所述诊断试剂盒检测的待测mirna为非小细胞肺癌潜在生物标志物mir-196a2t。

15、所述的应用，将待测mir-196a2t和/或mir-196a2c作为待测mirna样品使用所述的方法进行反应，反应结束后，测其荧光光谱。

16、检测非小细胞肺癌生物标志物mir-196a2t的诊断试剂盒，包含rnase h酶、荧光发夹h1、荧光发夹h2、a链、b链、splintr连接酶、连接反应缓冲液、消化反应缓冲液；

17、荧光发夹h1的dna序列为：agaaactgtctgagttacgttcttgt(fam)aactcagaca；荧光发夹h2的dna序列为：gtaactcagacagtttcttgtct(tamra)gagttacaagaac；

18、a链的dna序列为：gtaactcag；b链的dna序列为：*acagtttcttgt，其中*代表的是磷酸基团修饰。

19、所述的诊断试剂盒，连接反应缓冲液含有tris-hcl、mgcl2、atp、dtt，ph7.0～8.0。优选地，连接反应缓冲液ph7.5。

20、所述的诊断试剂盒，消化反应缓冲液含有tris-hcl、kcl、mgcl2、dtt，ph7.3～9.3。优选地，消化反应缓冲液ph8.3。

21、所述mir-196a2t的序列为acaagaaacugucugaguuac，mir-196a2c的序列为acaagaaacugccugaguuac。

22、作为一种优选技术方案，步骤(1)中，所述连接反应体系中a链与b链的终浓度为500nm，splintr连接酶终浓度为0.125～1.25u/μl；连接反应缓冲液组分为50mm tris-hcl、10mm mgcl2、1mm atp、10mm dtt，ph7.5。进一步优选的，所述孵育时间为10min。

23、作为一种优选技术方案，步骤(2)中所述消化反应缓冲液为10×消化反应缓冲液，稀释后的rnase h酶浓度为0.02～0.5u/μl。其中，10×消化反应缓冲液组分为：500mmtris-hcl、750mm kcl、30mm mgcl2、100mm dtt，ph8.3。优选的，稀释后的rnase h酶浓度为0.2u/μl，孵育时间为20min。

24、作为一种优选技术方案，步骤(3)中，将经退火程序处理的比例为1：0.5～4的荧光发夹h1和h2加入到步骤(2)反应液中，在16～37℃下孵育0.5～4h，使得激发链ab打开荧光发夹h1，h1所暴露的部分进一步打开荧光发夹h2，h2所暴露的部分再进一步打开荧光发夹h1，进而生成不同长度的dna双链。在所述杂交链式反应中，荧光发夹h1中的fam荧光基团与荧光发夹h2中的tamra荧光基团相互靠近，在485nm的激发波长下，发生荧光共振能量转移，使得518nm处(fam荧光基团发射波长)荧光下降，584nm处(tamra荧光基团发射波长)荧光上升。优选的，荧光发夹h1和h2比例为1：1，浓度为250nm，温度为16℃，孵育时间为2h。

25、作为一种优选技术方案，所述荧光发夹h1和h2为h1.1/h2.1、h1.1/h2.2、h1.1/h2.3、h1.1/h2.4、h1.2/h2.1、h1.2/h2.2、h1.2/h2.3、h1.2/h2.4中任意一对荧光发夹组合，优选为h1.1/h2.2。荧光发夹序列信息如下：

26、h1.1：agaaactgtctgagttacgttcttgt(fam)aactcagaca；

27、h1.2：agaaactgtctgagttacgttcttgtaact(fam)cagaca；

28、h2.1：gtaactcagacagtttcttgtctgagtt(tamra)acaagaac；

29、h2.2：gtaactcagacagtttcttgtct(tamra)gagttacaagaac；

30、h2.3：gtaactcagacagtttcttgt(tamra)ctgagttacaagaac；

31、h2.4：gtaactcagacagtttctt(tamra)gtctgagttacaagaac。

32、本发明的原理图见附图1。将mir-196a2作为检测目标，当发生单碱基位点突变时，特定位点的c碱基突变为u碱基。当mirna未发生突变时，b链5’端的第一个碱基无法与mir-196a2c可能发生的突变位点互补结合，那么splintr连接酶无法催化连接反应，a链与b链无法通过连接生成ab链，后续的杂交链式反应便无法发生，荧光发夹h1和h2在体系中亚稳态共存。当mirna发生突变时，b链5’端的第一个碱基与mir-196a2t的突变位点互补结合，splintr连接酶发挥作用并连接a链与b链相邻接头，ab链生成。经rnase h酶的消化作用，mir-196a2t-ab链复合物中的mir-196a2t被降解，ab链保留。ab链能够与亚稳态荧光发夹h1中的a*、b部分结合，从而打开荧光发夹h1。h1中所暴露的b*、c部分进一步与亚稳态荧光发夹h2中的b、c*部分结合，从而打开荧光发夹h2。h2中所暴露的a、b*部分又与h1中的a*、b部分结合以打开h1。最后，通过交叉打开荧光发夹h1和h2来生成长的双链dna，使得h1中的fam荧光基团与h2中的tamra荧光基团相互靠近，发生荧光共振能量转移。在检测过程中，检测目标物mir-196a2t的浓度越高，参与杂交链式反应的发夹越多，荧光共振能量转移现象越明显，518nm处荧光下降越多，584nm处荧光上升越多，即if(584)/if(518)值越大。其中，if(518)为518nm处荧光强度，if(584)为584nm处荧光强度。

33、本发明建立一种基于杂交链式反应的生物传感器用于检测mirna相关单核苷酸多态性，dna发夹可通过与杂交链式反应的激发链结合，兼具识别底物并放大信号的作用，具有高效等温扩增、超高灵敏度、结构灵活性等优势。与传统rna测序、聚合酶链式反应等mirna相关单核苷酸多态性检测方法相比，展现出反应条件温和、操作简单、减少核酸扩增酶的使用等优势，降低对精密仪器和训练有素的操作人员的需求，降低检测成本，更适合在家庭以及资源匮乏地区的现场检测。

34、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：(1)本发明利用splintr连接酶对单碱基突变的强敏感性，实现了对癌症相关生物标志物mir-196a2野生型与单碱基突变型的区分。通过对连接反应中连接时间、splintr酶量等条件的优化，保证了野生型mir-196a2c的零信号检出，避免非特异性扩增所导致的假阳性结果，实现了零背景检测。(2)本发明引入rnase h核酸酶以清除连接产物mirna-ab链复合物中的mirna，保证从双链结构中释放出的ab链顺利激发后续杂交链式反应进行扩增，实现了连接反应与杂交链式反应之间的联用。(3)本发明通过荧光共振能量转移信号强弱反映杂交链式反应程度。当发生杂交链式反应时，if(518)值下降，if(584)值上升，两者的比值if(584)/if(518)被进一步放大。选择if(584)/if(518)作为目标物的定量参考数值，提高了检测的灵敏度。此外，本发明与利用sybrgreen i染料嵌入双链dna的杂交链式反应方法相比，大大降低了荧光背景信号。(4)本发明基于杂交链式反应的超灵敏荧光传感方法用于非小细胞肺癌潜在生物标志物mir-196a2t精确定量，通过连接反应中splintr连接酶对连接接头处碱基配对的敏感度进行了第一次特异性筛选，通过杂交链式反应中激发链与发夹h1之间的完全互补的必要性进行了第二次特异性筛选，实现了对单碱基突变型mir-196a2t的零背景信号检测，即所发明的传感方法对未发生单碱基突变的野生型mir-196a2c无信号检出。