一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒的配制与应用的制作方法

本发明属于病原体核酸提取试剂盒，具体涉及一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒的配制与应用。

背景技术：

1、养殖业是农业的一个重要分支，主要包括家禽养殖、畜牧养殖和水产养殖三个细分产业。家禽养殖以禽肉和禽蛋为主要产出，而畜牧养殖业以猪牛羊肉为主要产出，水产养殖以水产品为主要产出。我国作为养殖大国，养殖规模位居世界前列，然而养殖生物病害的多发性和严重性已成为养殖业健康发展的制约因素，因此，对养殖生物疾病防治技术的研究和推广已成为当务之急。养殖样本病原体通常包含真菌、细菌、寄生虫与病毒，而样本类型较多，如血液样本、体液样本、组织样本、环境样本，当前对养殖样本病原体提取方法较少，如吸附柱提取法与磁珠提取法。其中，磁珠提取法自动化程度较高，易于普及与推广，但因为方法学原因，此方案要得到高纯度核酸比较困难。

2、由于动物本体、取样操作与养殖场地卫生原因，养殖类样本相对于其他人类临床样本，其样本复杂程度较高，如环境样本中猪场样本可能含有粪便、消毒水、饲料等杂质，鱼塘中亦如此，且在临床样本中，可能包含多种细菌、病毒或寄生虫样本，核酸提取试剂盒提取性能要求高，而在市售试剂盒中，少有对样本类型与病原体高兼容性的，因此，急需研制一款针对于从养殖复杂样本中，对各类病原体进行有效核酸提取的试剂盒。

3、cn115247171a公开了一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法，包括裂解结合液、蛋白酶k、磁珠、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ与洗脱液。发明者仅针对在血液、唾液、咽拭子与血浆中，对adv1与h1n1病毒进行提取测试，其样本类型单一，且只对病毒进行提取测试，无法证明对其他病原体核酸进行有效提取。

4、cn114958830a公开了一种同时提取病原体dna和rna的试剂盒及其应用，包括裂解液、蛋白酶k、磁珠、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ与洗脱液。发明者仅针样本中dna/rna病毒进行提取测试，只对病毒进行提取测试，无法证明对其他病原体核酸进行有效提取。

5、cn113699145b公开了一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法，包括裂解液、蛋白酶k、磁珠、洗涤液a、洗涤液b与洗脱液。此发明虽可针对多样本类型（全血、血清、血浆、唾液、咽拭子与粪便样本）中的dna/rna病毒、细菌、支原体与衣原体进行提取，但其验证测试中，只使用了乙流病毒、支原体、腺病毒与大肠杆菌，其中病毒与革兰氏阴性菌较易裂解提取，而忽略了致病性高且更难裂解的革兰氏阳性菌，无法说明发明试剂盒的裂解性能满足对革兰氏阳性菌的裂解能力。

6、在现有市售提取试剂盒中，难兼容多种复杂样本类型检测。因此需有一种可实现自动化提取的，对核酸提取效率高，所得核酸纯度不抑制pcr扩增，且提取时间短的提取试剂盒。

技术实现思路

1、本针对上述问题，本发明的目的在于，在现有发明的基础上，制作一种可对多类型样本（血液样本、唾液样本、精液样本、拭子样本、污水样本与组织样本）中提取病原体（dna病毒、rna病毒、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与寄生虫）的核酸提取试剂盒，可实现在30分钟内依靠全自动核酸提取工作站对病原体核酸进行提取纯化，所得核酸浓度与市售试剂盒相比，浓度更高，pcr抑制物更少。

2、本发明解决技术问题采用如下技术方案：

3、一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，所述提取试剂的组分包括研磨珠、消化液、蛋白酶k液、磁珠液、裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2与洗脱液。

4、所述裂解结合液包括：包含离液盐2~5mol/l、非离子表面活性剂0.5~10%、阴离子表面活性剂0.1~5%、ph缓冲液10~100mmol/l、醇类10~50%、离子螯合剂0.1~10mmol/l。

5、所述消化液中，包括阴离子表面活性剂0.1~5%、非离子表面活性剂、离子螯合剂0.1~10mmol/l与ph缓冲液10~100mmol/l。

6、所述洗涤液1中，包含离液盐2~5mol/l，非离子表面活性剂0.5~10%、ph缓冲液10~100mmol/l、醇类10~50%。

7、所述洗涤液2中，包含醇类10~50%以及ph缓冲液10~100mmol/l。

8、所述洗脱液中，包含离子螯合剂0.1~10mmol/l与ph缓冲液10~100mmol/l。

9、所述蛋白酶k液为浓度20mg/ml的蛋白酶k溶液。

10、所述磁珠液为浓度100mg/ml的二氧化硅包覆的磁珠。

11、所述研磨珠中，包括不锈钢研磨珠与氧化锆研磨珠。

12、优选地，所述离液盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、高碘酸钠、碘化钠、溴酸钠中的一种或多种。

13、优选地，所述非离子表面活性剂包括peg 200、np-40、triton x-305、tween-20、tween -80、brij-58、aeo-9中的一种或多种。

14、优选地，所述阴离子表面活性剂为sds、sls、tls、sds、lds、sdbs中的一种或多种。

15、优选地，所述ph缓冲液为tris-hcl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液与醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种。

16、优选地，所述醇类为乙醇、异丙醇中的一种或多种。

17、优选地，所述离子螯合剂包括edta、edta·na2、egta、8-hq中一种或多种。

18、优选地，所述不锈钢研磨珠与氧化锆研磨珠的质量之比为1:2。

19、本发明的有益效果如下：

20、本发明的核酸提取试剂盒可对多类型样本（血液样本、唾液样本、精液样本、拭子样本、污水样本与组织样本）中提取病原体（dna病毒、rna病毒、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与寄生虫），可实现在30分钟内依靠全自动核酸提取工作站对病原体核酸进行提取纯化，所得核酸浓度与市售试剂盒相比，浓度更高，pcr抑制物更少。

21、相对于市面在售病原体核酸提取试剂盒，本发明可依附全自动核酸提取工作站，在30分钟内获得更高质量的病原体核酸。对于传统苯酚-氯仿法，本发明毒性更低，保护实验操作人员健康。对于吸附柱提取法，本发明可实现自动化操作，提高实验效率。

技术特征：

1.一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂的组分包括研磨珠、消化液、蛋白酶k液、磁珠液、裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2与洗脱液。

2.根据权利要求1所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液包括：离液盐2~5mol/l、非离子表面活性剂0.5~10%、阴离子表面活性剂0.1~5%、ph缓冲液10~100mmol/l、醇类10~50%、离子螯合剂0.1~10mmol/l；

3.根据权利要求2所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述离液盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、高碘酸钠、碘化钠、溴酸钠中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述非离子表面活性剂peg 200、np-40、triton x-305、tween-20、tween -80、brij-58、aeo-9中的一种或多种。

5.根据权利要求2所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为sds、sls、tls、sds、lds、sdbs中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述ph缓冲液为tris-hcl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液与醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种。

7.根据权利要求2所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述醇类为乙醇、异丙醇中的一种或多种。

8.根据权利要求2所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述离子螯合剂包括edta、edta·na2、egta、8-hq中一种或多种。

9.根据权利要求2所述的一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒，其特征在于，所述不锈钢研磨珠与氧化锆研磨珠的质量之比为1:2。

技术总结
本发明属于核酸提取试剂的技术领域，具体涉及一种磁珠法养殖复杂样本核酸提取试剂盒的配制与应用。所述提取试剂的组分包括研磨珠、消化液、蛋白酶K液、磁珠液、裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2与洗脱液，可对多类型样本（血液样本、唾液样本、精液样本、拭子样本、污水样本与组织样本）中提取病原体（DNA病毒、RNA病毒、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与寄生虫）的核酸提取试剂盒，可实现在30分钟内依靠全自动核酸提取工作站对病原体核酸进行提取纯化，所得核酸浓度与市售试剂盒相比，浓度更高，PCR抑制物更少。

技术研发人员：黄庚锐,谭杰峰,张佑欢,许锦涛
受保护的技术使用者：广州奕昕生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5