松材线虫EmDEA等温荧光快速检测引物组合、试剂盒和检测方法与流程

本发明涉及分子检测，具体地说，是涉及松材线虫emdea等温荧光快速检测的相关引物组合、试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、松材线虫属小杆目(rhabditida)、垫刃亚目(tylenchina)、滑刃总科(aphelenchoidea)、滑刃科(aphelenchoididae)、寄生滑刃亚科(parasitaphelenchinae)、伞滑刃属(bursaphelenchus)。松材线虫是松树萎蔫病的病原，发源于北美洲，在美国、加拿大等国的针叶木(主要是松属)中普遍发生，但这些原产国的松树品种大多数抗性较强，因此松树萎蔫病仅零星发生，为害很小。其原因可能是北美松材线虫与松树长期共同进化，松树获得了较强的抗病性或耐病性，并且当地传媒天牛传播松材线虫的效率也相对较低，同时有大量的自然天敌存在。然而，当松材线虫通过北美输出的松木原木、木质包装等传入亚洲、欧洲各国后，由于寄主、媒介昆虫、环境及天敌等条件的改变，松材线虫引起了巨大的危害。

2、松材线虫是我国危害最大的林业外来入侵物种之一，也是我国内检和外检的重要检疫对象。海关口岸或林业系统必须对进境木材、木质包装或国内跨省调运的松木及其包装进行松材线虫检测鉴定，对携带松材线虫的松木进行检疫除害处理，以防止松材线虫持续传入我国并进一步在国内传播扩散。

3、目前已有的松材线虫检测鉴定方法主要是形态学鉴定方法和各种分子生物学鉴定方法。

4、形态学鉴定方法主要根据松材线虫和拟松材线虫等近似种的雌虫尾部及尾尖突形状。虽然通过尾形的观察可以基本区分两种线虫，但是由于不同地区、不同株系的松材线虫群体间存在一定的形态差异，而拟松材线虫又分为东亚亚种和欧洲亚种，松材线虫可进一步分为r型株系和m型株系，使得形态鉴定更为复杂。并且，一些松材线虫r型株系雌虫也可能有短尾尖突。这就需要鉴定人员不仅能够熟练制作玻片和使用显微镜，而且需要较丰富的鉴定经验。并且，形态学的鉴定方法局限于成虫，无法对松材线虫幼虫进行鉴定。

5、由于上述形态学方法的局限，研究人员已经研发了多种分子生物学方法，包括种特异pcr鉴定方法、its-rflp鉴定方法、实时荧光pcr鉴定方法、dna条形码鉴定方法，以及lamp、rpa、rca、sea等多种等温扩增鉴定方法。上述方法中，种特异pcr鉴定方法和its-rflp鉴定方法需要进行pcr扩增和凝胶电泳观察，过程长且操作繁琐；dna条形码鉴定方法则需要进一步进行目标基因片段的dna测序和分析；实时荧光pcr鉴定方法需要昂贵的设备，一般只能在实验室内完成检测。lamp、rpa、rca、sea等多种等温扩增方法目前还存在一定的缺点，如易污染、操作步骤繁琐、dna提取过程复杂、无法直接用于检测木屑等等。

6、emdea(enzymes-mediated duplex exponential amplification)等温荧光快检方法是一种酶介导双重指数扩增快速核酸检测技术，通过多酶协作对靶标核酸及荧光探针进行双重放大，短时间内达到极高检测灵敏度与特异性。与lamp、rpa、rca、sea等多种等温扩增方法相比，emdea等温荧光快检方法不仅在引物特异性匹配的条件下实现靶标核酸指数级放大，并且采用荧光探针进行信号放大，比例大于100倍，因而具有极高的检测准确性和检测效率。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的松材线虫的emdea等温荧光快检方法。

2、本发明采用的技术方案是：

3、松材线虫emdea等温荧光快速检测引物组合，所述引物组合包括特异性引物和荧光探针，所述特异性引物包括上游引物its forward和下游引物its reverse，序列如下所示：

4、its forward：

5、5′-aagctaatacgactcactataggggcaatgttaggcaccatctgtttta-3′；

6、its reverse：5′-agtgctcgattgtcgtgcgcggctaa-3′；

7、所述荧光探针的序列为：

8、its probe：

9、5′-ccctctcgccccgcacggacaaacag/f-dt/g/idsp/g/q-dt/agaagatattggtc-3’c

10、3spacer；

11、其中：“f-dt”指标记有荧光报告基团f的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“q-dt”指标记有荧光淬灭基团q的dt核苷酸，“c3 spacer”指3’羟基封闭。

12、本发明中，所述引物its forward的5’端带有rna聚合酶启动子，优选t7 rna启动子；

13、本发明中，its probe探针第27位碱基t标记荧光报告基团，探针第30位碱基t标记荧光淬灭基团，探针第28位碱基g修饰四氢呋喃。

14、its probe探针中，所述的荧光报告基团f包括但不限于fam、fitc、tet、hex、joe、罗丹明类、rox、alexafluor染料、atto染料、dylight染料、cyanine染料、fluoprobes染料、sulfo cy染料、seta染料、iris染料、setau染料、srfluor染料或square染料，优选fam基团；所述的荧光淬灭基因q包括但不限于dabcyl、tamra、mgb、bhq-0、bhq-1、bhq-2或bhq-3，优选bhq-1基团。

15、具体地，所述的荧光报告基团f可以为但不限于fam(羧基荧光素，carboxyfluorescein，绿色荧光)、fitc(异硫氰酸荧光素，fluorescein isothiocyanate)、tet(四氯-6-羧基荧光素，tetrachloro fluorescein)、hex(六氯-6-甲基荧光素，hexachlorofluorescein)、joe(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)、罗丹明类(rhodamine染料如r110，tamra、texas red等)、rox、alexafluor染料(如alexa350,alexa405,alexa430,alexa488,alexa500,alexa514,alexa532,alexa546,alexa555,alexa568,alexa594,alexa610,alexa633,alexa635,alexa647,alexa660,alexa680,alexa700,alexa750,alexa790)、atto染料(如atto 390,atto 425,atto 465,atto 488,atto 495,atto 514,atto 520,atto 532,atto rho6g,atto 542,atto 550,atto 565,atto rho3b,atto rho11,atto rho12,atto thio12,atto rho101,atto 590,atto 594,atto rho13,atto 610,atto 620,atto rho14,atto 633,atto 647,atto 647n,atto655,atto oxa12,atto 665,atto 680,atto 700,atto 725,atto 740)、dylight染料、cyanine染料(如cy2,cy3,cy3.5,cy3b,cy5,cy5.5,cy7,cy7.5)、fluoprobes染料、sulfo cy染料、seta染料、iris染料、setau染料、srfluor染料或square染料；所述的荧光淬灭基团q可以为但不限于dabcyl、tamra、mgb、bhq-0、bhq-1、bhq-2、bhq-3。

16、本发明还提供含有上述引物组合的松材线虫emdea等温荧光快速检测试剂盒。

17、进一步，所述试剂盒包括上游引物its forward、下游引物its reverse、荧光探针、ema重组酶、ema聚合酶、mgoac、ema缓冲液、rna转录酶、修饰核酸酶和核酸外切酶ⅲ。

18、所述修饰核酸酶是一种可逆的、化学修饰的核酸酶，具有可逆性，修饰核酸酶的活性被封闭，不具备降解双链dna的活性，核酸酶的修饰基团通过溶于水发生修饰基团脱落，或者加热脱落修饰集团后，核酸酶的活性被激活，可以选择性降解双链dna，而不降解rna。

19、所述核酸酶可以为dsn酶，经过修饰的dsn酶，在活性未激活之前，对t7 rna聚合酶介导的转录作用无抑制作用；去除修饰基团、活性激活后的dsn酶，能在反应体系中降解扩增的双链dna，降低产物导致的后续检测风险；能在反应体系中降解扩增的rna/dna中的与探针结合的rna形成的双链dna，而不降解rna，单个rna链上dna探针降解后，新的探针结合上去，该过程可以反复进行。

20、用2,3-二甲基或其他类似化合物修饰的dsn酶，可以通过冻干等方式保持其修饰状态，dsn酶没有活性，然后通过加热恢复活性状态，加热时间及温度取决于其修饰的比例。一般加热至42度以上，例如加热至45℃，或者在42℃加热15分钟以上，修饰基团会脱落，dsn酶恢复活性；dsn酶可以被其他双链特异性核酸酶替代，双链特异性核酸酶可以特异性降解双链dna，或者dna/rna杂合链中的dna链。

21、修饰dsn酶，封闭其活性的方法，除了马来酸或其衍生物，也可以被其他化学试剂所替代；或者被特异性抗体，或有dna，rna或dna与rna杂合的适配体封闭其活性；或者将dsn酶与扩增体系分离到不同腔体，在扩增反应结束后，通过混合的方法，将dsn酶加入扩增产物中，让dsn酶发挥作用。

22、除了选用修饰dsn酶同时作为探针切除酶以及双链dna水解酶，另一方面，也可以用两个或者更多的酶分别作为探针切除酶和双链dna水解酶，并且修饰，核酸扩增结束后，使探针切除酶发挥功能，核酸检测完成后，使双链dna水解酶再发挥功能。

23、优选地，所述的修饰核酸酶为修饰dsn酶，通过2,3-二甲基马来酸酐或柠康酸酐2-甲基马来酸酐进行修饰。

24、所述ema重组酶、ema聚合酶、ema缓冲液由苏州晶睿生物科技有限公司生产。ema重组酶、ema聚合酶、ema缓冲液制成冻干粉产品形式，直接购买使用。

25、所述rna转录酶为t7 rna聚合酶。

26、所述核酸外切酶ⅲ可以为exo酶。核酸外切酶ⅲ可以切割与dna特异性结合的荧光探针，产生荧光信号。

27、优选地，所述的试剂盒包括检测试剂冻干粉、激活液、阳性对照、阴性对照；所述试剂冻干粉包括上游引物its forward、下游引物its reverse、荧光探针its probe、ema酶干粉、rna转录酶、修饰核酸酶、核酸外切酶ⅲ；所述ema酶干粉包括dntp、ema重组酶、ema聚合酶、ema缓冲液、海藻糖、甘露醇、mgoac和peg20000；所述激活液包括rntp，复溶液，所述复溶液包括peg20000、氯化钾、tis乙酸缓冲液、乙酸镁；所述的阳性对照为松材线虫阳性质粒，阴性对照为te缓冲液。

28、ema酶干粉、复溶液由苏州晶睿生物科技有限公司生产。

29、优选地，所述试剂盒中的检测冻干粉，在使用时用激活液将冻干粉复溶，配置得到emdea等温扩增反应体系。

30、进一步，所述emdea等温扩增反应体系为20μl，包括以下组分：

31、浓度为5um-10um的上游引物its forward 0.25μl、浓度为5um-10um下游引物itsreverse 0.25μl、浓度为2.5μm的修饰dsn酶0.2μl、浓度为5um-10um的荧光探针its probe0.1μl、exo酶0.1μl、t7 rnapolymerase mix 0.08μl、浓度为15-20mm的ntp set solution1.2μl、2×复溶液10μl、浓度为0.6m-1.2m的乙酸镁0.38μl、无核酶水2.44μl，模板dna5μl，ema酶干粉。

32、修饰dsn酶、exo酶由苏州晶睿生物科技有限公司生产。

33、所述修饰dsn酶为2,3-二甲基马来酸酐修饰的dsn酶。

34、进一步，所述试剂盒还可以包括dna提取试剂，用于提取待测样本的模板dna。

35、或者采用市售的核酸提取试剂盒提取待测样本的模板dna。提取待测样本的模板dna的方法包括硅胶膜吸附柱法、磁珠法、简单的加热处理法、酶促释放法中的至少一种。

36、本发明还提供所述松材线虫emdea等温荧光快速检测试剂盒在快速恒温检测鉴定松材线虫中的应用。

37、进一步，本发明提供一种利用松材线虫emdea等温荧光快速检测试剂盒进行快速恒温检测鉴定松材线虫的方法，所述方法包括如下步骤：

38、(1)提取待测样本的dna核酸；

39、(2)以提取的dna为模板，根据所述试剂盒组分，配制emdea等温扩增反应体系，平行做阳性对照和阴性对照；

40、(3)进行等温扩增；扩增的模板进行rna转录；转录的rna结合荧光探针后被酶水解，释放荧光信号，实时检测荧光信号，根据检测到的荧光信号值进行结果分析，判断样本中是否存在松材线虫。

41、本发明中，等温扩增体系、转录体系和荧光检测体系为同管反应。

42、所述待测样本可以为待测木屑样本或单条待测线虫样本。

43、本发明基于松材线虫核糖体its区片段序列，设计上下游特异引物及荧光探针，进行等温核酸扩增及荧光快速检测。在靶标序列进行指数级快速扩增的同时，探针与靶标序列结合后启动酶介导的探针水解，探针上荧光基团与淬灭基团分离，产生并积累荧光信号，根据荧光曲线的特征以及荧光值超过设定的阈值的时间来进行线虫的分子生物学鉴定。

44、进一步，本发明等温扩增和检测的反应过程是：

45、(1)在恒温扩增条件下(多酶介导恒温扩增)，实现松材线虫靶标核酸特异性的指数级扩增；

46、(2)在its forward引物中引入的t7 rna启动子，使得扩增双链dna中含有t7 rna启动子；

47、(3)dna在持续进行指数级扩增的同时，t7 rna聚合酶识别t7启动子，对靶标序列进行rna转录，得到转录rna；转录rna和荧光探针结合；

48、(4)在扩增窗口期结束后，升温至45度或通过较长时间保温使修饰的核酸酶具有活性，识别与rna特异性结合的探针并切割产生荧光信号，该切除探针过程反复进行，提高反应的信号强度；

49、(5)核酸酶活性启动后，非特异性识别并降解双链dna，消除核酸扩增的产物积累及潜在的污染风险；

50、(6)核酸外切酶ⅲ(exonucleaseⅲ，即exoⅲ)切割和dna结合的荧光探针产生荧光信号，进一步提高检测灵敏度，缩短检测时间。

51、进一步，所述emdea等温扩增反应体系为20μl，包括以下组分：

52、浓度为5um-10um的上游引物its forward0.25μl、浓度为5um-10um下游引物itsreverse 0.25μl、浓度为2.5μm的修饰dsn酶0.2μl、浓度为5um-10um的荧光探针its probe0.1μl、exo酶0.1μl、t7 rnapolymerase mix 0.08μl、浓度为15-20mm的ntp set solution1.2μl、2×复溶液10μl、浓度为0.6m-1.2m的乙酸镁0.38μl、无核酶水2.44μl，模板dna5μl，ema酶干粉。

53、进一步，所述步骤(3)中，所述的等温扩增的程序为：30-48℃温度下，每隔0.1-5分钟(优选每隔0.5-2分钟)检测一次荧光信号，反应时间为10-180分钟。

54、进一步，优选在42℃下反应15分钟到30分钟，每30s读取一次荧光值。本发明发现，反应体系在42℃保持大概15分钟以后，dsn酶就会开始具有活性，因此可以不用加热到45℃以上使修饰dsn酶失去修饰基团具有活性，而出于步骤简便的目的，在42℃下保温15分钟以上即可。

55、所述步骤(3)中，所述结果分析方法为：待测样品的tt值小于或等于15时，则判定结果为阳性；tt值大于15或无与阳性对照相似的典型扩增曲线时，则判定结果为阴性。

56、具体的，通过荧光曲线与tt值(荧光值超过内设阈值的时间)判定emdea扩增的结果：首先验证测试有效：阳性对照具有典型扩增曲线与tt值，阴性对照、空白对照无荧光与tt值，在阳性对照、阴性对照和空白对照正确的前提下，待测样品的tt值小于或等于15时，则判定结果为阳性；待测样品的tt值大于15或无与阳性对照相似典型扩增曲线时，则判定结果为阴性。

57、具体地，优先判定阴性对照和阳性对照，应符合下表要求，证明本次测试有效。再按照要求对待测样品的tt值进行阴阳性判定。检测松材线虫核酸的判断标准如表1所示：

58、表1松材线虫核酸的阴阳性判断标准

59、

60、进一步，所述步骤(1)中，提取待测样本的dna核酸可按以下步骤进行：

61、对于线虫样本：挑取单条线虫加入50μl裂解液中，95℃加热10min，离心，得到dna模板。

62、裂解液为苏州晶睿生物科技有限公司生产，也可采用市售dna提取试剂盒。

63、对于木屑样本：

64、将100mg木屑加入750μl裂解液，充分混合，95℃加热10min，离心后吸取10μl上清液，沿管壁中下部加入到含有40μl 1x te缓冲液的稀释液管内，混匀离心后备用。

65、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

66、(1)高灵敏度：应用本发明的方法可以实现对am(10-18mol)级别的dna检测，检测限远低于单条线虫虫体，漏检率极低。

67、(2)高特异性：检测试剂与体系与近似物种无交叉反应，特异性强。

68、(3)快速：10分钟内完成快速核酸制备，20分钟内完成核酸检测，可在半小时内完成检测。高通量：配合16孔掌上荧光检测仪，能对14个样品同时进行检测，全部检测过程在30min内完成。

69、(4)便捷：实现单管多个试剂的一步法检测，操作方便，步骤简单。

70、(5)本发明提供了一种快速、准确鉴定松材线虫的方法，应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在30分钟内完成检测，灵敏度高，实用性强，可以对进境种苗中的该线虫进行准确鉴定，满足海关口岸和林业系统工作者对松材线虫快速检测的需求，为我国口岸防止松材线虫入侵和林业部门松材线虫病普查和防控提供了便携、快速、可靠的检测手段与技术保障，对于防止松材线虫非中国种入侵、保护我国农林生产安全具有重要意义。