1.松材线虫emdea等温荧光快速检测引物组合,所述引物组合包括特异性引物和荧光探针,所述特异性引物包括上游引物its forward和下游引物its reverse,序列如下所示:
2.如权利要求1所述的引物组合,其特征在于所述引物its forward的5’端带有rna聚合酶启动子;
3.一种松材线虫emdea等温荧光快速检测试剂盒,包括包括如权利要求1或2所述的引物组合。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括上游引物its forward、下游引物its reverse、荧光探针、ema重组酶、ema聚合酶、mgoac、ema缓冲液、rna转录酶、修饰核酸酶和核酸外切酶ⅲ。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于修饰核酸酶为修饰dsn酶,通过2,3-二甲基马来酸酐或柠康酸酐2-甲基马来酸酐进行修饰,修饰dsn酶没有活性,通过加热至42℃以上,修饰基团脱落,dsn酶恢复活性。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒包括检测试剂冻干粉、激活液、阳性对照、阴性对照;所述试剂冻干粉包括上游引物its forward、下游引物itsreverse、荧光探针its probe、ema酶干粉、rna转录酶、修饰核酸酶、核酸外切酶ⅲ;所述ema酶干粉包括dntp、ema重组酶、ema聚合酶、ema缓冲液、海藻糖、甘露醇、mgoac和peg20000;所述激活液包括rntp,复溶液,所述复溶液包括peg20000、氯化钾、tis乙酸缓冲液、乙酸镁;所述的阳性对照为松材线虫阳性质粒,阴性对照为te缓冲液。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒中的的检测冻干粉,在使用时用激活液将冻干粉复溶,配置得到emdea等温扩增反应体系;
8.一种利用如权利要求3~7之一所述的松材线虫emdea等温荧光快速检测试剂盒进行快速恒温检测鉴定松材线虫的方法,其特征在于所述方法包括如下步骤:
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于所述步骤(3)中,所述的等温扩增的程序为:30~48℃温度下,每隔0.1-5分钟检测一次荧光信号,反应时间为10-180分钟。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于所述步骤(3)中,所述的等温扩增的程序为:在42℃下反应15分钟到30分钟,每30s读取一次荧光值;