因子IX变体及其在治疗中的用途的制作方法

本发明涉及因子ix变体、编码变体的分子、编码变体的核酸、包含变体或编码变体的核酸的组合物以及它们在调节止血的方法中例如在治疗或预防凝血障碍例如b型血友病中的用途。

背景技术：

0、背景

1、人凝血因子ix(fix)是凝血级联反应的关键组分。编码因子ix的基因中的某些功能丧失(loss-of-function)改变导致因子ix缺乏，从而导致出血性疾病b型血友病(也称为克雷司马斯病)，其通常需要因子ix替代疗法。

2、因子ix是一种单链糖多肽，分子量为57kda。它在肝脏中合成并在46个氨基酸(aa)的前前肽(prepropeptide)的裂解后分泌到血流中。因子ix作为415个氨基酸的非活性酶原在血流中循环。它包含n末端gla结构域，然后是两个表皮生长因子(egf)结构域、一个活化肽和在c末端的胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶结构域。在血管损伤后，因子ix通过35-aa活化肽在r145-a146和r180-v181处的蛋白水解被转化为其活性形式因子ixa，导致形成两条多肽链，n末端轻链(aa1-145；18kda)和c末端重链(aa181-415；28kda)，它们通过二硫键连接在一起。这种活化的因子ix在凝血级联反应中的作用是通过与ca2+离子、膜磷脂和因子viiia的相互作用将因子x活化为其活性形式(因子xa)。xa因子裂解凝血酶原，其产生活性凝血酶。凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，其交联以形成血凝块。

3、b型血友病是由无功能或缺失因子ix引起的，并且通常需要因子ix替代疗法，例如来自血浆的因子ix浓缩物或因子ix的重组形式。尽管有效，但一些目前的因子ix替代疗法受到所施用的因子ix多肽的半衰期短的影响，因此需要以高剂量频繁静脉注射。此外，蛋白质替代需要大量的因子ix多肽，这可能是昂贵的。因此，需要具有改善的生物学特性的因子ix多肽。具体而言，期望减少实现必需水平的因子ix活性所需的因子ix多肽的量。还期望降低施用频率，即增加施用之间的时间段。

4、本发明人已经发现在某些氨基酸位置相对于野生型因子ix多肽中那些位置的氨基酸具有取代的因子ix变体可能具有有利的特性，这使得它们特别适用于治疗或预防出血性疾病例如b型血友病。与野生型因子ix多肽相比，甚至与其他已知的因子ix变体相比，本发明的因子ix变体可能具有更高的促凝活性(“比活性”)。较高的比活性在预防和/或治疗中可能是有利的，因为需要施用较少的总因子ix多肽以实现与野生型因子ix或与具有较低的比活性的其他因子ix变体相同水平的因子ix活性。较高的比活性也可能是有利的，因为它允许更快的治疗反应(例如，在治疗急性出血事件时)。此外，具有较高的比活性的因子ix变体在基因治疗方法中可能特别有用，例如因为它们可以允许施用较低的病毒载体剂量，从而减少或避免在一些受试者中看到的抗载体免疫反应(例如抗衣壳细胞免疫)，同时仍然提供临床上显著水平的因子ix活性。

5、本发明人还显示了本发明的因子ix变体可以与半衰期增强剂连接(例如，通过可裂解的接头)，同时保持增加的因子ix活性的能力。因此，此类因子ix变体可能具有更长的体内功能半衰期以及在活化时更高的促凝血活性。这可能是特别有利的，因为达到与野生型因子ix或其他因子ix变体相同水平的因子ix活性所需的总因子ix多肽更少，并且另外需要更少的施用频率(因为每次施用提供更长时间的具有增加的因子ix活性的因子ix多肽)。

技术实现思路

1、本发明提供相对于其他因子ix变体和/或相对于野生型因子ix具有改善的生物学特性的因子ix变体。特别地，如本文所述的因子ix变体相对于野生型因子ix和/或相对于其他因子ix变体可以具有更大的凝血活性(更大的比活性)。本发明还提供包含与半衰期增强剂连接的因子ix变体的分子，所述半衰期增强剂为因子ix变体提供更长的体内功能半衰期。本发明的因子ix变体和包含其的分子因此特别用于预防或治疗出血性疾病例如b型血友病。因子ix变体或包含其的分子通常是重组多肽。

2、一方面，本发明因此提供了包含因子ix变体多肽的分子，所述变体多肽在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h(组氨酸)，或在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含除r(精氨酸)之外的氨基酸。因此，本发明提供了例如在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含氨基酸v(缬氨酸)、t(苏氨酸)或w(色氨酸)例如v或t特别是v的分子。

3、本领域技术人员将理解，多肽上下文中的术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用。

4、编号是指在seq id no：1中鉴定的野生型因子ix中的氨基酸位置。例如，“包含在对应于seq id no：1的410位的位置处包含氨基酸h的因子ix变体多肽的分子”是指包含在对应于seq id no：1的410位(其在该位置具有氨基酸e)的位置处包含氨基酸h的因子ix变体多肽的分子，例如因子ix变体多肽在seq id no：1的410位包含氨基酸h。表明该特征的另一种方式是例如“410h”或“e410h”。

5、本发明还提供了包含因子ix变体多肽的分子，该变体多肽在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h，并且在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含除r之外的氨基酸。

6、对应于野生型因子ix的338位的氨基酸可以是相对于具有在338位处具有氨基酸r的相同序列的因子ix多肽增加因子ix变体多肽的比活性的任何氨基酸。比活性通常使用体外一阶段凝血测定确定，例如aptt测定和其他方法是本领域技术人员已知的。在一个优选的实施方案中，因子ix活性是使用体外的基于aptt的一阶段凝血测定确定的，通常如实施例3中所述。

7、因子ix变体多肽的相对比活性相对于具有在338位处具有氨基酸r的相同序列的因子ix多肽可以增加至少3倍或至少4倍(其中在每个多肽中，对应于410位的氨基酸是e)。

8、因子ix变体多肽的相对比活性相对于具有在338位处具有氨基酸r的相同序列的因子ix多肽可以增加至少2.5倍、至少3.0倍或至少3.5倍(其中在每个多肽中，对应于410位的氨基酸是h)。

9、当比较在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含除r之外的氨基酸的因子ix变体多肽时，因子ix变体多肽的相对比活性相对于具有在410位处具有氨基酸e和在338位处具有氨基酸r的相同序列的因子ix多肽可以增加至少5倍、至少6倍或至少7倍。在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含除r之外的氨基酸的因子ix变体多肽的相对比活性因此相对于野生型因子ix(例如seq id no：1)可以增加至少5倍、至少6倍或至少7倍。

10、当比较在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含除r之外的氨基酸的因子ix变体多肽时，因子ix变体多肽的相对比活性相对于(i)具有在410位处具有氨基酸h和在338位处具有氨基酸r的相同序列的因子ix多肽和(ii)具有在410位处具有氨基酸e和在338位处具有氨基酸r的相同序列的因子ix多肽中的每一个可以增加至少1.5倍。

11、在一个实施方案中，该分子因此可以在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h，以及在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含选自由v、t、w、l、y或e的氨基酸，例如v、t、w或l，例如v、t或w，例如v或t，特别是v。

12、在其他实施方案中，对应于野生型因子ix的338位的位置处的氨基酸是除r和l之外的氨基酸。

13、在示例性实施方案中，因子ix变体多肽在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含选自v、t和w的氨基酸。

14、在另一个实施方案中，因子ix变体多肽在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含选自v和t的氨基酸。

15、在一个具体实施方案中，因子ix变体多肽在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处的氨基酸v。

16、在一个具体实施方案中，因子ix变体多肽在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含氨基酸t。

17、在一个具体实施方案中，因子ix变体多肽在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处的氨基酸w。

18、在一些实施方案中，因子ix变体多肽具有在如上所述的一个或多个位置处的氨基酸，并且其包含与seq id no：1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，因子ix变体多肽包含与seq id no：1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，因子ix变体多肽包含与seq id no：1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在这些实施方案的任一个中，因子ix变体多肽具有生物活性，即它能够活化因子x(即产生因子xa)。

19、特别地，因子ix变体多肽可以具有在如上所述的一个或多个位置处的氨基酸，并且其可以与seq id no：1具有至少70％的序列同一性。在一个具体实施方案中，因子ix变体多肽与seq id no：1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在特定实施方案中，因子ix变体多肽与seq idno：1具有至少95％的序列同一性。在这些实施方案的任一个中，因子ix变体多肽具有生物活性，即它能够活化因子x(即产生因子xa)。

20、因此，一个示例性实施方案是因子ix变体多肽，其在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含选自v、t和w的氨基酸(例如v或t，特别是v)，并且其中因子ix变体多肽包含与seq id no：1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

21、另一个示例性实施方案是因子ix变体多肽，其在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含选自v、t和w的氨基酸(例如v或t，特别是v)，并且其中因子ix变体多肽包含与seq id no：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

22、另一个示例性实施方案是因子ix变体多肽，其在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含选自v、t和w的氨基酸(例如v或t，特别是v)，并且其中因子ix变体多肽包含与seq id no：1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

23、另一个示例性实施方案是因子ix变体多肽，其在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h和在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含选自v、t和w的氨基酸(例如v或t，特别是v)，并且其中因子ix变体多肽包含与seq id no：1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

24、如上所述，在这些实施方案的任一个中，因子ix变体多肽具有生物活性，即它能够活化因子x(即产生因子xa)。

25、本发明的因子ix变体多肽通常由天然存在的氨基酸组成。然而，也可以存在一种或多种非天然存在的氨基酸。

26、两个氨基酸序列之间的百分比序列同一性意味着，当比对时，在比较两个序列时氨基酸的百分比是相同的。序列同一性百分比计算为比对的序列中相同氨基酸的百分比，不包括338位和/或410位中的氨基酸。与另一个序列“具有”(或“含有”)x％序列同一性的序列是指该序列与该其他序列x％相同。

27、例如，在其中因子ix变体多肽中对应于seq id no：1的410位的氨基酸不同于seqid no：1中该位置的氨基酸但因子ix变体多肽中对应于seq id no：1的338位的氨基酸与seq id no：1中该位置的氨基酸相同的实施方案中，则序列同一性百分比计算为比对的区域内相同氨基酸的百分比，并且不包括410位中的氨基酸。然而，在其中因子ix变体多肽中对应于seq id no：1的410位的氨基酸不同于seq id no：1中该位置的氨基酸并且因子ix变体多肽中对应于seq id no：1的338位的氨基酸不同于seq id no：1中该位置的氨基酸的实施方案中，则序列同一性百分比计算为比对的区域内相同氨基酸的百分比，并且不包括410位和338位中的氨基酸。

28、在其中因子ix变体多肽与半衰期增强部分(例如白蛋白)连接(任选地通过可裂解的接头(即融合蛋白))或在确定与seq id no：1的序列同一性时与一些其他多肽连接的实施方案中，仅考虑分子的因子ix变体多肽部分用于计算序列同一性的目的，即排除任何接头并排除分子的半衰期增强部分。这也适用于例如接头源自因子ix序列时。

29、类似地，当因子ix变体多肽对应于全长因子ix多肽的一个或多个片段(例如它是因子ix的活化形式)时，当确定与seq id no：1的序列同一性时，存在于seq id no：1中但在因子ix变体多肽(例如活化肽)中缺失的任何部分出于计算序列同一性的目的被排除在外。

30、在一个具体实施方案中，因子ix变体多肽中除338位和410位之外的所有残基都是野生型的，即不包括338位和410位中的氨基酸，存在与seq id no：1的100％的序列同一性。

31、在一些实施方案中，因子ix变体多肽如seq id no：11、12、13或14中所定义，例如seq id no：11、12或13，特别是seq id no：11或12。seq id no：11定义了具有特别高的因子ix比活性的因子ix变体多肽。因子ix变体多肽也可以是seq id no：11、12、13或14中任一个(例如seq id no：11、12或13)的生物活性片段(即它具有促凝血活性，例如活化的因子ix)，并且包括如seq id no：11、12、13或14中任一个(例如seq id no：11、12或13)所定义的氨基酸338和410。因子ix变体也可以是与seq id no：11、12、13或14(例如seq id no：11、12或13)或那些seq id no的片段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％或至少99％的序列同一性的多肽。在这些实施方案的任一个中，因子ix变体多肽具有生物活性，即它能够活化因子x(即产生因子xa)。

32、如本文所述的因子ix变体可以是包含该变体并且进一步包含一个或多个附加部分的分子的一部分。例如，因子ix变体多肽可以与半衰期增强部分连接。半衰期增强部分可以是另一种不同的多肽，例如白蛋白(例如重组人白蛋白)、抗体的fc部分(例如igg fc)、人绒毛膜促性腺激素的c末端肽(ctp)或非结构化重组多肽(例如xten)。因子ix变体也可以被聚乙二醇化。因子ix变体可以以任何这些方式直接或通过接头连接。接头可以是可裂解的接头，例如可蛋白水解裂解的接头。或者，可以使用不可裂解的接头。

33、或者，本发明的分子可由本文提供的因子ix变体多肽组成，即没有任何附加部分，例如半衰期增强部分。

34、本发明还提供了编码本发明的因子ix变体或编码包含其的分子的核酸，其例如用于基因治疗，例如用于预防或治疗b型血友病。

35、本发明还提供了包含该核酸的载体。合适的示例性载体是本领域技术人员已知的并且可以选自腺病毒载体、腺病毒相关载体、逆转录病毒载体、质粒和慢病毒载体。

36、本发明的另一方面包括一种细胞，其包含本发明的核酸或载体。

37、进一步提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的因子ix变体、核酸、载体或细胞，以及药学上可接受的载体。

38、因子ix变体、核酸、载体或细胞可以纯化形式提供。因子ix变体、核酸、载体或细胞可以以分离的形式提供。因子ix变体多肽可以被翻译后修饰。

39、本发明还提供了用作药物的如本文所述的因子ix变体、包含其的分子、核酸、载体、细胞或药物组合物。

40、例如，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗或预防受试者的凝血障碍的方法，包括向受试者施用治疗有效量的因子ix变体(或包含因子ix变体的分子、编码因子ix变体的核酸分子等)。此类方法在预防或治疗其中需要促凝血活性(例如，以预防、减少或抑制出血)并且包括但不限于血友病特别是b型血友病的病症中具有功效。因此，本发明提供了用于治疗或预防受试者的凝血障碍，特别是治疗或预防b型血友病(先天性因子ix缺乏症)患者的出血的方法。

41、本发明还提供了用于治疗或预防受试者的凝血障碍，特别是治疗或预防b型血友病患者的出血的因子ix变体(或包含因子ix变体的分子、编码因子ix变体的核酸分子等)。

42、还提供了因子ix变体(或包含因子ix变体的分子、编码因子ix变体的核酸分子等)在制备用于治疗或预防受试者的凝血障碍，特别是治疗或预防b型血友病患者的出血的药物中的用途。

43、治疗或预防可包括出血发作的按需控制、出血的围手术期管理和/或常规预防以预防或减少出血发作的频率。例如，治疗可能包括出血发作的按需控制或出血的围手术期管理。预防可能包括预防出血发作或减少出血发作的频率。

44、受试者通常是人。受试者可以是成人或儿童。与健康受试者的血浆因子ix活性相比，受试者可能具有5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、1-5％或1％或更低的基础(未经预防或治疗)血浆因子ix活性。

45、治疗或预防可涉及基因治疗，例如人基因治疗。基因治疗通常作为编码本发明的因子ix变体或编码包含本发明的因子ix变体的分子的载体例如腺病毒相关载体施用。

46、还提供了产生本发明的因子ix变体或包含本发明的因子ix变体的分子的方法，包括在使得表达该分子的条件下培养细胞。

47、因子ix变体多肽

48、根据本发明的因子ix变体多肽源自野生型因子ix的多肽序列。变体在一个或多个氨基酸位置与野生型因子ix中的相应位置不同，即变体相对于野生型因子ix中的相应位置具有一个或多个氨基酸取代。

49、例如，根据本发明的因子ix变体多肽可以在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h，以及在对应于野生型因子ix的338位的位置处包含除r之外的氨基酸。根据本发明的因子ix变体多肽可以另外地在相对于野生型因子ix的其他位置处包含氨基酸取代。

50、变体具有因子ix的生物学功能，即变体能够产生因子xa，任选地在因子ix变体多肽通过活化肽的切除转化为其活性形式(因子ixa)之后。因子ix的活化裂解可以在体外实现，例如通过因子xia或因子viia/tf实现。测量因子ix活性的合适的体外测定是本领域技术人员已知的(例如，一阶段凝血测定，例如aptt测定、显色测定等)。体外的基于aptt的一阶段凝血测定是用于确定因子ix活性的优选测定，通常如实施例3中所述。

51、由于相对于野生型的至少一个“功能获得”氨基酸取代，变体通常与衍生该变体的野生型因子ix多肽相比具有增加的因子ix比活性，即变体是“过度活性的”。

52、因子ix变体多肽可以源自任何哺乳动物物种的因子ix多肽序列。在一个具体实施方案中，因子ix变体多肽源自人来源的因子ix多肽序列。基因id：2158(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2158)、genbank登录号nm_000133.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_000133.3)、np_000124.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_000124.1？report＝genpept)和uniprot条目p00740(https://www.uniprot.org/uniprot/p00740)提供了野生型人因子ix的氨基酸和/或核苷酸序列的例子。

53、根据本发明的因子ix变体多肽可以源自成熟的(即不包括信号肽和前肽)野生型因子ix，例如人来源的，其氨基酸序列显示在seq id no：1中。多肽序列是人因子ix的“同种型1”。

54、seq id no：1的多肽在338位具有氨基酸r，并且在410位具有氨基酸e(此处提及的氨基酸使用本领域公知的单字母代码；例如，“r”代表精氨酸，“e”代表谷氨酸等)。seq idno：1中的338位和410位在肽酶s1结构域中。338位和410位在下面以粗体和下划线表示。被切除以形成fixa(活化的因子ix)的35-aa活化肽标有下划线。

55、

56、seq id no：1的多肽的示例性多核苷酸编码序列示于seq id no：2。

57、术语“源自野生型因子ix的多肽序列”(或类似措辞)是指当两个序列比对时，因子ix变体多肽与野生型因子ix多肽具有一定程度的序列同一性。例如，因子ix变体多肽可与seq id no：1具有至少70％等的序列同一性，如上所述。因子ix变体多肽具有生物活性，即它能够活化因子x(即产生因子xa)。

58、术语“野生型因子ix”是指天然存在的因子ix多肽序列，即该序列相对于天然存在的多肽序列的序列未经人工修饰。这意味着天然存在的多肽序列中没有一个氨基酸被不同的氨基酸取代。seq id no：1是野生型多肽序列的一个实例，但该术语也包括片段、截短等，如下文所例示。例如，该术语包括具有修饰的n末端或c末端的多肽，包括末端氨基酸缺失或添加，只要这些多肽基本上保留因子ix的活性。该术语还包括因子ix的任何天然多态性变体。例如，以33％的频率出现的常见天然多态性变体是在对应于seq id no：1中t148位的位置中呈现丙氨酸(a)的因子ix多肽。该t148a多态性变体显示在seq id no：7中。因此，本文中对seq id no：1的所有提及也可以指seq id no：7。

59、因子ix变体多肽也可以源自包含信号和/或前肽的野生型因子ix，如seq id no：3所示。seq id no：3包含信号肽(aa1-28)和前肽(propeptide)(aa29-46)。它在本领域中被称为人因子ix的前体，或称为前前肽因子ix。具有前肽但缺少信号肽的因子ix也称为前肽因子ix。编码seq id no：3的多肽的示例性多核苷酸编码序列示于seq id no：4。

60、因子ix变体多肽也可以源自野生型因子ix的一个或多个片段，例如它可以源自活化的因子ix，其含有因子ix的两个片段(它缺少存在于seq id no：1中的介于中间的“活化肽”)。seq id no 5和6分别显示了人活化因子ix的轻链和重链，它们通过二硫键连接在一起。另一个例子是人因子ix的同种型2，它缺少在seq id no：1的47-84位的38-aa链段。

61、或者，因子ix变体多肽可以源自野生型因子ix的截短或融合物。

62、因此，因子ix变体多肽可以采用各种不同的形式，只要它保持如上所述的因子ix的生物学功能(即它是功能性因子ix变体多肽)。因此，本发明的因子ix变体多肽可以是野生型前前肽因子ix、前肽因子ix、成熟因子ix、活化的因子ix的变体或其片段、截短、融合、同种型、多态性变体等。除非另有说明，否则所有这些形式的因子ix在本文中统称为“因子ix”。

63、本文对氨基酸位置的引用是相对于seq id no：1中的编号，即氨基酸位置是对应于seq id no：1中的该位置的那些氨基酸位置。这意味着，例如，如果因子ix变体多肽基于seq id no：1但另外包括因子ix的前肽和信号肽(它们总共为46个氨基酸长，并且在seq idno：1中缺失)，然后例如“在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h的因子ix变体多肽”是指因子ix变体多肽在变体多肽的456位(410+46)包含h。类似地，如果因子ix变体多肽基于因子ix的活化形式(其缺少seq id no：1的35-aa活化肽)，则例如“在对应于野生型因子ix的410位的位置处包含氨基酸h的因子ix变体多肽”是指因子ix变体多肽在变体多肽的375位(410-35)包含h，其对应于活化的因子ix的重链的230位。技术人员能够通过将变体的多肽序列与seq id no：1的多肽序列进行比较并鉴定比对部分来确定因子ix变体多肽中的相关位置。

64、因子ix变体多肽(或包含其的分子)可以作为“分离的”或作为“纯化的”多肽提供。该术语可以指通过本发明的分离的核酸分子的表达产生的多肽。或者，该术语可以指已经与天然与之相关的其他蛋白质充分分离的蛋白质(例如，以“基本上纯”的形式存在)。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物或不干扰基本活性并且例如由于不完全纯化或添加稳定剂而可能存在的杂质的存在。

65、术语“基本上纯的”是指包含至少50-60重量％的感兴趣的化合物(例如，因子ix变体多肽或包含其的分子)，特别是至少75重量％或至少90-99重量％或更多的感兴趣的化合物。纯度可以通过适合于感兴趣的化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc分析等)来测量。

66、如下文更详细描述的，在本发明的一些实施方案中，因子ix变体作为核酸提供，例如用于基因治疗。在此类实施方案中，提供了编码如本文所述的因子ix变体多肽的核酸。核酸可以与病毒载体例如腺病毒相关载体或慢病毒载体一起施用至受试者。基因编辑方法也可用于向受试者提供如本文所述的因子ix变体多肽。

67、根据本发明的因子ix变体多肽(或包含其的分子，或编码其的核酸，或包含其的药物组合物)可以是治疗性的，即当施用至患有因子ix缺乏症例如b型血友病的受试者(例如人)时，可以观察到预防或治疗效果。这意味着因子ix活性的血浆水平可以增加，至少是暂时的。这种预防或治疗效果可以例如通过测量预防或治疗后受试者的血浆因子ix活性，并将其与预防或治疗前受试者的血浆因子ix活性进行比较来确定。预防或治疗后因子ix活性的增加表明具有预防或治疗效果。当预防或治疗后的因子ix活性足以预防、减少或抑制出血时，也实现了预防或治疗效果。预防或治疗后的因子ix活性可能超出病理范围。预防或治疗后的因子ix活性可能与正常人血浆中的因子ix活性相当。因子ix活性可以使用本领域技术人员已知的任何因子ix活性测定来测量，例如使用aptt测定(aptt值的降低表明因子ix活性增加)。因此，在一个优选的实施方案中，因子ix活性是使用体外的基于aptt的一阶段凝血测定来确定的，通常如实施例3中所述。

68、根据本发明的因子ix变体多肽(或包含其的分子)优选在受试者通常是人受试者中是非免疫原性的。这意味着在向受试者施用多肽或包含其的分子后，或在受试者中体内表达多肽或分子后，受试者不表现出超过针对相应野生型多肽观察到的免疫反应的针对变体多肽或分子的可测量的免疫反应(例如中和抗体)。然而，如有必要，可以避免或治疗任何此类免疫反应，例如使用皮质类固醇。用于评估免疫原性的测试是本领域已知的，例如参考文献1的实施例11。

69、制备因子ix变体多肽

70、本发明的因子ix变体多肽(或包含其的分子)可以使用本领域技术人员众所周知的标准技术来制备，例如实施例1中所述。

71、例如，可以使用标准诱变技术(例如定点诱变)修饰野生型因子ix(例如seq idno：2)的cdna序列，使得其编码所需的因子ix变体多肽，例如在对应于野生型因子ix(其在该位置处编码氨基酸e)的410位的位置处编码氨基酸h并在对应于野生型因子ix(其在该位置处编码氨基酸r)的338位的位置处编码氨基酸v。基于天然因子ix前导肽(如seq id no：3所示)或本领域技术人员已知的替代物，可以使用用于重组蛋白生产目的的n末端前导肽。

72、可以将cdna序列插入合适的表达质粒以表达重组因子ix变体多肽。这通常使用哺乳动物细胞进行(例如，用于瞬时表达的hek或用于稳定表达的cho细胞系)，但也可以使用可以产生糖基化和正确折叠的蛋白质的其他类型的细胞。

73、随后可以纯化重组因子ix变体多肽，例如使用阴离子交换色谱。

74、重组因子ix变体多肽可以与其他药剂和/或药学上可接受的载体组合。重组因子ix变体多肽也可以被冻干。

75、包含因子ix变体多肽的分子

76、本发明的因子ix变体多肽可以单独提供，即没有与因子ix变体多肽连接的任何非因子ix部分。在此类实施方案中，“包含因子ix变体多肽的分子”是指由因子ix变体多肽组成的分子。

77、或者，本发明的因子ix变体多肽可以作为包含变体并且进一步包含一个或多个附加部分的分子的一部分提供。一个或多个附加部分通常不同于因子ix，即它们不具有如上定义的因子ix的生物学功能(它们不具有产生因子xa的能力)。这意味着本身不具有因子ix的功能的因子ix的片段(例如包含因子ix衍生的多肽序列的片段但的接头)可以是这样的“一个或多个附加部分”，即它们不是因子ix变体多肽的一部分，但它们可以是包含因子ix变体多肽的分子的一部分。

78、半衰期增强部分和接头

79、包含因子ix变体多肽的示例性分子是其中因子ix变体多肽与半衰期增强部分连接的分子。

80、半衰期增强部分可包含一种或多种多肽(半衰期增强多肽，hlep)，例如白蛋白或免疫球蛋白，或两者任一的片段或衍生物。在一个实施方案中，hlep是白蛋白，例如重组人白蛋白。在另一个实施方案中，hlep是抗体(免疫球蛋白)的片段，例如fc片段，例如igg fc，例如igg1 fc。或者，hlep可以是人绒毛膜促性腺激素的c末端肽(ctp)。hlep也可以是非结构化重组多肽(例如xten)。此类分子在本领域中也称为融合多肽。

81、因子ix变体可以通过可裂解的接头连接到hlep。通常，可裂解接头可被活化因子ix的相同蛋白酶裂解。因此，此类可裂解接头提供融合多肽的高摩尔比活性。例如，在参考文献1中教导了合适的可裂解接头。

82、因子ix变体也可以被聚乙二醇化/peg化。

83、包含本发明的因子ix变体多肽的分子可包含一个半衰期增强部分，或多于一个半衰期增强部分。因此，措辞“半衰期增强部分”涵盖一个或多个半衰期增强部分。半衰期增强部分可以是相同类型的。半衰期增强部分可以是不同类型的。例如，因子ix变体多肽可以连接至xten(例如xten72)并且另外连接至fc结构域(例如人igg1 fc)。

84、优选地，与非融合的因子ix变体多肽相比，半衰期增强部分能够将因子ix变体多肽的体内(血浆中)半衰期延长至少约25％。优选地，半衰期增强部分能够将因子ix变体多肽的体内(血浆中)半衰期延长至少约50％，更优选延长超过100％。

85、本发明的融合多肽的体内半衰期通常被确定为终末半衰期或β-半衰期。

86、白蛋白

87、如本文所用，“白蛋白”统称白蛋白多肽或氨基酸序列，或具有白蛋白的一种或多种功能活性(生物学活性)的白蛋白片段、变体或类似物。特别地，“白蛋白”可以指人白蛋白(ha)或其片段，尤其是如本文seq id no：9所示的人白蛋白的成熟形式。白蛋白也可以源自其他物种，特别是其他脊椎动物。

88、融合多肽的白蛋白部分可包含如seq id no：9中所述的全长ha序列，或者它可包含其能够稳定或延长因子ix变体多肽的治疗活性的一个或多个片段。此类片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包括来自ha序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可以包括ha的特定结构域的部分或全部。这些和其他合适的白蛋白部分(包括变体)描述于参考文献1中。

89、白蛋白家族的结构相关家族成员也可以用作hlep。例如，甲胎多肽(afp，参考文献2)是白蛋白家族的成员，并且也可用于延长因子ix变体多肽的半衰期。此类半衰期增强多肽描述于参考文献3中。另一种选择是afamin(afm，参考文献4)或维生素d结合多肽(dbp，参考文献5)。也可以使用这些多肽的片段。

90、在使用白蛋白hlep的实施方案中，白蛋白通常作为与因子ix变体多肽的遗传融合物提供。这意味着单个cdna分子编码因子ix变体多肽和白蛋白部分，任选地具有编码接头例如可裂解接头的间插序列。

91、具有间插可裂解接头的示例性因子ix变体多肽(r338v+e410h)白蛋白融合多肽示于seq id no：15。

92、免疫球蛋白

93、免疫球蛋白(ig)或其片段也可用作hlep。合适的免疫球蛋白的例子是igg，或igg片段，例如fc区。fc区可以是fc结构域(例如，两条多肽链，各自包含铰链区(或铰链区的一部分)、ch2区和ch3区)。因此，在一个具体实施方案中，本发明的因子ix变体多肽直接或通过接头与fc结构域融合。在使用接头的实施方案中，接头可以是可裂解的。

94、单体、二聚体和杂合体都包括在内。例如，本发明提供了包含两条多肽链的异源二聚体，其中第一条链包含与免疫球蛋白(例如igg1)的铰链区(或铰链区的一部分)、ch2区和ch3区连接的本发明的因子ix变体多肽，并且第二条链包含免疫球蛋白(例如igg1)的铰链区(或铰链区的一部分)、ch2区和ch3区。

95、在另一个实施方案中，本发明提供包含两条多肽链的同源二聚体，其中每条链包含与免疫球蛋白(例如igg1)的铰链区(或铰链区的一部分)、ch2区和ch3区连接的本发明的因子ix变体多肽。

96、本发明还提供包含与免疫球蛋白(例如igg1)的铰链区(或铰链区的一部分)、ch2区和ch3区连接的本发明的因子ix变体多肽的单体。

97、合适的因子ix igg fc融合分子构型的其他实例见于例如参考文献6。

98、与本发明的因子ix变体多肽一起使用的示例性fc多肽(源自人igg1 fc结构域)显示在seq id no：16中。与本发明的因子ix变体多肽一起使用的另一个示例性fc多肽(源自人igg1 fc结构域)显示在seq id no：17中。

99、在这些实施方案的任一个中，因子ix变体多肽可以直接或经由接头连接至fc区。在使用接头的实施方案中，接头可以是可裂解的或不可裂解的。在特定实施方案中，接头是可裂解的。示例性可裂解接头示于seq id no：8。

100、在一个具体实施方案中，本发明提供了一种分子，其包含与人igg1 fc区(例如seqid no：16或seq id no：17)连接的如本文所述的因子ix变体多肽。人igg1 fc区可以直接或通过接头任选地可裂解接头与因子ix变体多肽连接。

101、在另一个具体实施方案中，本发明提供包含两条多肽链的异源二聚体，其中第一条链包含与人igg1 fc区连接的本发明的因子ix变体多肽，并且其中第二条多肽链包含人igg1 fc区。人igg1 fc区可以是seq id no：16或seq id no：17。在第一条多肽链中，人igg1fc区可以直接或通过接头任选地可裂解接头与因子ix变体多肽连接。

102、eftrenonacog alfa是因子ix fc融合体的一个例子。还参见参考文献7、8或9。

103、人绒毛膜促性腺激素的c末端肽(ctp)

104、与本发明的因子ix变体多肽一起使用的另一个示例性半衰期增强部分是人绒毛膜促性腺激素的c末端肽(ctp)。ctp基于31个氨基酸长度的天然肽，即人绒毛膜促性腺激素(hcg)的β链的c末端肽。

105、ctp的一个或多个单元可以与本发明的因子ix变体多肽融合。ctp的一个或多个单元可以融合到因子ix的n末端和/或c末端，优选融合到c末端。

106、在一个实施方案中，本发明提供了一种ctp修饰的因子ix变体多肽，其包含与三至五个ctp连接的如本文所述的因子ix变体多肽，任选地其中ctp附接至因子ix变体多肽的c末端。在一个具体实施方案中，ctp的三个串联单元与因子ix变体多肽附接，任选地在因子ix变体多肽的c末端附接。

107、在这些实施方案的任一个中，至少一个ctp可以通过接头附接到因子ix变体多肽。接头可以是肽键。接头可以是可裂解的。

108、在示例性实施方案中，ctp序列包含seq id no：18。在另一个示例性实施方案中，ctp序列包含seq id no：19。在另一个示例性实施方案中，ctp序列包含seq id no：20。

109、其他合适的ctp序列和相关方法是本领域技术人员已知的，例如参见参考文献10、11或12。

110、非结构化重组多肽

111、与本发明的因子ix变体多肽一起使用的另一个示例性半衰期增强部分是非结构化重组多肽。这种非结构化重组多肽的一个实例是xten，参见例如参考文献13。

112、在一个实施方案中，本发明因此提供与至少一个xten融合的因子ix变体多肽。xten可以通过插入到因子ix变体多肽序列中而与因子ix变体多肽融合，同时保持因子ix的生物活性。例如，xten可以在当插入xten时不阻止凝血期间活化肽的裂解的位置处插入在因子ix变体的活化肽中的两个相邻氨基酸之间的。或者，xten可融合至因子ix变体多肽的c末端和/或n末端，优选c末端。xten可以通过接头例如可裂解的接头与因子ix变体多肽的c末端和/或n末端(优选c末端)融合。接头可以被凝血酶裂解。

113、优选的xten是xten72。示例性xten72序列显示在seq id no：21中。替代的xten序列显示在seq id no：22中。其他合适的序列和方法公开于例如参考文献14、15或16中。

114、在一个具体的实施方案中，本发明提供了因子ix变体多肽，其包含与活化肽连接的xten72，并且其中因子ix变体多肽还在因子ix变体多肽的c末端与人igg1 fc结构域连接。

115、聚乙二醇化/peg化

116、与本发明的因子ix变体多肽一起使用的另一个示例性半衰期增强部分是聚乙二醇(peg)。

117、糖聚乙二醇化(glycopegylation)在本文使用的术语“聚乙二醇化/peg化”的范围内。例如，约40kda的peg部分可以共价附接至因子ix变体多肽，例如通过活化肽内的特定n-连接的聚糖。糖聚乙二醇化的因子ix多肽的一个例子是nonacog beta pegol(也参见参考文献17)，其中因子ix的n157或n167(根据seq id no：1编号)处的聚糖的平均一个非还原性末端通过氨基附接到与两个peg聚合物缀合的神经氨酸(聚合物的总平均分子量约为42kda)。因子ix多肽的聚乙二醇化也教导于例如参考文献18、19和20。

118、接头

119、包含半衰期增强部分的本发明的分子可以使用可裂解的接头，特别是可蛋白水解裂解的接头。接头通常位于因子ix变体多肽和半衰期增强部分之间。接头可在接头被凝血级联的蛋白酶(例如还能够将因子ix变体多肽转化为其活化形式例如fxia或viia/组织因子(tf)的蛋白酶)裂解后释放因子ix变体多肽。当hlep是白蛋白时，可裂解的接头特别有用。

120、尽管期望具有增强的因子ix体内半衰期，但期望在因子ix被活化后限制其半衰期，以降低促血栓形成作用的风险，尤其是在过度活性的因子ix变体多肽的情况下。因此，在一些实施方案中，可裂解的接头将因子ix变体多肽与半衰期增强部分连接，从而提供相对于非融合多肽具有更长半衰期的因子ix变体多肽。然而，一旦发生出血并且凝血级联已经开始，凝血级联的蛋白酶活化因子ix变体多肽，其相对于例如相应的野生型因子ix具有增加的比活性。同时，接头被裂解，并且活化的因子ix变体多肽从半衰期增强部分释放，从而降低因任何延长的因子ix活性增加而导致的血栓形成作用的风险。

121、接头可以是因子ix的片段，优选参与因子ix活化的片段。例如，接头可以包含因子ix序列的这样的片段，由n末端残基例如脯氨酸残基延伸。示例性可裂解接头显示在seq idno：8中。其他可裂解接头在参考文献1中描述。

122、当在至少一种凝血相关测定(其实例是本领域技术人员已知的，例如aptt一阶段测定，例如如实施例3中所述)中测量时，与具有不可裂解接头(例如ggggggv)的相应分子相比，包含经由间插可裂解接头与半衰期增强部分连接的因子ix变体多肽的本发明的分子可具有至少25％更高的摩尔比活性。优选地，与没有可裂解接头的相应分子相比，包含经由间插可裂解接头与半衰期增强部分连接的因子ix变体多肽的本发明的分子具有至少50％、更优选至少100％增加的摩尔比活性。

123、因子ix活性

124、因子ix活性可以使用任何合适的测定来确定。因子ix活性在本领域中通常被称为比活性(在本文中也被称为摩尔比活性)。

125、摩尔比活性定义为每摩尔(或例如nmole)的感兴趣的多肽的活性。摩尔比活性的计算允许直接比较不同多肽的活性。摩尔比活性不受不同多肽的不同分子量或光密度的影响。摩尔比活性可以如参考文献1的表2中示例的那样计算。

126、各种因子ix活性测定是本领域技术人员众所周知的，例如一阶段测定，例如aptt测定，以及显色测定。

127、例如，活化部分凝血活酶时间(aptt)测定是众所周知的因子ix测定。因此，在一个优选的实施方案中，因子ix活性是使用体外的基于aptt的一阶段凝血测定确定的。此类示例性测定在以下实施例3中描述。它是可商购获得的(例如，sl，siemenshealthcare)。用最佳量的磷脂和表面活化剂孵育测试血浆(例如，含有一定量的样品(例如来自受试者、细胞培养上清液或纯化的因子ix多肽)的因子ix耗尽的血浆)导致内在凝血系统的因子的活化。钙离子的添加触发凝血过程；测量形成纤维蛋白凝块的时间。针对who国际fix浓缩标准校准的内部次级标准品可用作参考。

128、然而，其他已知的因子ix活性测定也可用于确定因子ix多肽的比活性。

129、当在至少一种因子ix活性测定(例如当使用体外的基于aptt的一阶段凝血测定测量因子ix活性时aptt值的降低，例如如实施例3中所述)中观察到这种增加时，发生相对于对照的比活性的“增加”。

130、核酸

131、本发明还提供了编码本发明的因子ix变体或编码包含其的分子的核酸，例如用于基因治疗，例如用于预防或治疗b型血友病。

132、核酸可以是dna(例如cdna)。核酸可以是rna(例如mrna)。

133、核酸可以作为分离的核酸提供。当应用于dna时，该术语是指一种dna分子，它与在其起源于的生物体的天然存在的基因组中直接相邻(在5'和3'方向)的序列分离。例如，“分离的核酸”可以包括插入载体例如质粒或病毒载体中或整合到原核生物或真核生物的dna中的dna或cdna分子。关于本发明的rna分子，术语“分离的核酸”主要是指由如上定义的分离的dna分子编码的rna分子。或者，该术语可以指已经与在其天然状态下(即，在细胞或组织中)相关联的rna分子充分分离的rna分子，使得它以“基本上纯的”形式存在。

134、载体

135、本发明还提供了包含该核酸的载体。合适的示例性载体是本领域技术人员已知的并且可以选自腺病毒载体、腺病毒相关载体、逆转录病毒载体、质粒和慢病毒载体。

136、术语“载体”是指载体核酸分子(例如，rna或dna)，其中可以插入核酸序列，例如用于引入宿主细胞中，在其中它可以被表达和/或复制。该术语包括质粒。“表达载体”是包含基因或核酸序列的特化载体，其具有在宿主细胞中表达所需的必要调节区。

137、术语“可操作地连接”是指将编码序列的表达所必需的调节序列置于dna分子中相对于编码序列的适当位置，以实现编码序列的表达。这个相同的定义有时适用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于其中产生杂合核酸分子的第一和第二核酸分子的核酸序列的排列。

138、在本发明的一个具体实施方案中，载体是病毒载体。可用于本发明的具有或不具有组织特异性启动子/增强子的病毒载体包括但不限于：腺相关病毒(aav)载体(例如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh10或其他衍生物和/或替代血清型)和杂合aav载体(例如，2、3、4、5种或更多种血清型的组合杂合体)、慢病毒载体和假型慢病毒载体(例如，埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(vsv)和猫免疫缺陷病毒(fiv))、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。aav可以是具有来自不同aav的衣壳蛋白(例如，aav血清型1-12中的任何一种或多种和其他的)和基因组(例如，aav血清型2)的杂合aav载体。aav载体是优选的，尤其是aav5。特别优选的是定向肝脏的载体(例如定向肝脏的aav载体)，尽管定向肌肉的载体也可能是有用的。

139、在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于施用病毒载体的方法，所述病毒载体包含编码因子ix变体多肽(或包含其的分子)或其功能片段的核酸序列。如本文所述，在施用此类腺病毒载体后变体多肽的表达可提高因子ix活性。

140、细胞

141、本发明的另一方面包括一种细胞，其包含本发明的核酸或载体。

142、细胞可以是人来源的。细胞可以是血小板、t细胞或造血细胞等。对于待治疗的受试者，细胞可以是自体的或同种异体的。可以例如通过将核酸掺入与启动子序列可操作地连接的基因组位置来离体修饰细胞，以便在细胞中表达本发明的因子ix变体多肽。aav载体可用于此目的。细胞也可以在体外培养(扩增)。合适的方法是本领域技术人员已知的。

143、药物组合物

144、本发明提供了一种药物组合物，其包含如上文所述的因子ix变体多肽、包含其的分子、核酸、载体或细胞。该组合物可用于施用于受试者，例如动物，通常是人受试者。

145、该组合物是药学上可接受的并且通常包括合适的载体。药学上可接受的载体的详细讨论可见于参考文献21。

146、该组合物可以是无菌的、不含热原和/或不含防腐剂的。

147、组合物中的因子ix变体多肽可以被冻干。冻干的多肽可用于用液体稀释剂例如稀释剂无菌注射用水重构。包含冻干的因子ix变体多肽的组合物中的典型赋形剂包括柠檬酸三钠二水合物、聚山梨醇酯80、甘露醇、蔗糖和/或hcl。

148、非冻干因子ix变体多肽可以以缓冲液体形式提供，例如在柠檬酸盐缓冲液中，任选地含有稳定剂和/或填充剂。

149、该组合物可以用于静脉内施用。其他施用途径包括肌内、口服、局部或肠胃外途径。

150、组合物可以是预防性的(防止出血)或治疗性的(治疗出血)。

151、治疗方法

152、本发明还提供了用作药物的本文所述的因子ix变体、包含其的分子、核酸、载体、细胞或药物组合物。

153、例如，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗或预防受试者的凝血障碍的方法，包括向受试者施用治疗有效量的因子ix变体(或包含因子ix变体的分子、编码因子ix变体的核酸分子等)。

154、凝血障碍可以是因子ix缺乏症，例如b型血友病。

155、此类方法在预防或治疗其中需要促凝血活性(例如，以预防、减少或抑制出血)并且包括但不限于血友病特别是b型血友病的病症中具有功效。因此，本发明提供了用于治疗或预防受试者的凝血障碍，特别是治疗或预防b型血友病(先天性因子ix缺乏症)患者的出血的方法。

156、“治疗有效量”是指将该量(例如本发明的因子ix变体多肽)作为单一剂量或作为一系列的一部分于向个体的施用对治疗或预防有效。

157、本发明还提供了用于治疗或预防受试者的凝血障碍、特别是b型血友病患者的出血的治疗或预防的因子ix变体(或包含因子ix变体的分子、编码因子ix变体的核酸分子等)。

158、还提供了因子ix变体(或包含因子ix变体的分子、编码因子ix变体的核酸分子等)在制备用于治疗或预防受试者的凝血障碍、特别是治疗或预防b型血友病患者的出血的药物中的用途。

159、更一般地，可受益于本发明的病症是出血病症，包括血友病(a型血友病、b型血友病、具有抑制性抗体的a型血友病和b型血友病患者；特别是b型血友病)、至少一种凝血因子(例如因子vii、ix、x、xi、v、xii、ii和/或von willebrand因子；特别是因子ix)的缺乏，组合的fv/fviii缺乏、维生素k环氧化物还原酶ci缺乏、γ-羧化酶缺乏；与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病(低凝性)、弥散性血管内凝血(dic)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药(即fxa抑制剂)相关的过度抗凝作用；和血小板病症，例如bernard soulier综合征、glanzman血栓母细胞血症和储存池缺乏症。

160、在一个特定的实施方案中，病症是b型血友病。

161、除非另有说明，否则术语“治疗”、“疗法”和“医治”可包括预防。如果将本发明的化合物或组合物(例如因子ix变体多肽)施用于受试者(例如具有因子ix缺陷例如b型血友病的人)导致治疗或预防效果，则治疗或预防疾病。这意味着当用至少一种因子ix测定测量时，受试者中因子ix活性的血浆水平在治疗后增加，至少是暂时的。因子ix活性通常使用体外的基于aptt的一阶段凝血测定确定(例如，如实施例3中所述)。增加可能是临床相关的，例如出血事件的频率或强度的减少。

162、在血浆中表达因子ix活性的一种方式是相对于正常人血浆的百分比。表达血浆中因子ix活性的另一种方式是血浆中相对于因子ix的国际标准的国际单位(iu)。一iu的因子ix活性相当于一毫升正常人血浆中因子ix的量。

163、检查预防或治疗的功效的一种方式是通过测量预防或治疗后受试者的血浆因子ix活性，并将其与预防或治疗前该受试者的血浆因子ix活性进行比较。预防或治疗后因子ix活性的增加(例如从正常人血浆的<1％或1％-5％或5-40％到正常人血浆的例如>40％、>50％或>60％峰值水平)表明预防或治疗效果。临床试验中已靶向正常人血清的5-10％的因子ix水平用于在预防时实现出血控制。

164、当预防或治疗后的因子ix活性足以预防、减少或抑制出血时，也实现了预防或治疗效果。

165、预防或治疗后的因子ix活性可能超出病理范围(例如，正常人血清的>40％的峰值水平)。预防或治疗后的因子ix活性可能与正常人血浆中的因子ix活性相当。

166、因子ix活性可以使用本领域技术人员已知的任何因子ix活性测定来测量，例如使用aptt测定(aptt值的降低表明因子ix活性增加)。因此，在一个优选的实施方案中，因子ix活性是使用体外的基于aptt的一阶段凝血测定来确定的，例如如实施例3所述。

167、与相应的野生型因子ix多肽相比，本发明的因子ix变体多肽在体内施用于受试者时可具有更高的比摩尔活性。例如，当使用本发明的因子ix变体多肽时，血浆因子ix活性的百分比增加(例如，使用体外的基于aptt的一阶段凝血测定测量)可能比使用相同摩尔量的相应野生型因子ix多肽时更高。对此的另一种描述方式是，与使用相同摩尔量的相应野生型因子ix多肽相比，使用本发明的因子ix变体多肽时的aptt时间更短。

168、可以建立因子ix变体多肽的有效初始剂量。使用以下公式确定按需治疗所需的剂量：

169、所需剂量(国际单位，iu)＝体重(kg)×所需因子ix升高(iu/dl或正常的百分比)×{观察到的恢复的倒数(每iu/dl的iu/kg)}

170、预期的因子ix升高(iu/dl或正常的百分比)＝剂量(iu)×恢复(每iu/kg的iu/dl)/体重(kg)

171、基于患者的临床状况和反应调整初始剂量。

172、为了确定足够的维持剂量，考虑因子ix变体多肽的任何延长的半衰期。用于预防b型血友病患者的出血的常规预防的典型方案是每周一次的35至50iu/kg。在每周一次方案上被良好控制的一些患者可以在10或14天的间隔内用高达75iu/kg进行治疗。

173、治疗的确切剂量和持续时间将取决于因子ix缺乏的严重程度、出血的位置和程度以及患者的临床状况、年龄和因子ix的恢复情况。

174、本文所述的治疗或预防方法包括施用病毒载体，所述病毒载体包含编码因子ix变体多肽(或包含其的分子)的核酸序列，例如用于基因治疗。优选的载体是腺病毒相关载体，例如aav5。也可以使用慢病毒载体。

175、也可以使用基因编辑方法来实现治疗或预防，例如使用锌指核酸酶或crispr(例如crispr/cas9)。此类方法可以使用本领域技术人员已知的方法(例如参考文献22)用编码本发明的功能性因子ix变体多肽的核酸替换缺陷的因子ix基因。另一种方法是使用本领域已知的方法(例如参考文献23、24或25)将编码本发明的因子ix变体多肽的核酸插入白蛋白基因座以确保尽管有肝细胞分裂但仍存在因子ix的长期表达。

176、本文所述的治疗或预防方法还包括向受试者施用细胞(例如，血小板、t细胞、造血细胞等)，其中所述细胞表达本发明的因子ix变体多肽，或其中所述细胞表达包含本发明的因子ix变体多肽的分子。相对于待治疗的受试者，细胞可以是自体的或同种异体的。

177、一般概念

178、除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，参考文献26-32等。

179、术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”，例如“包含”x的组合物可仅由x组成或可包括额外的东西，例如x+y。

180、与数值x相关的术语“约”是可选的并且意味着例如x±10％。

181、提及两个氨基酸序列之间的百分比序列同一性意味着，当比对时，在比较两个序列时氨基酸的百分比是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定这种比对和百分比同源性或序列同一性，例如在参考文献33的7.7.18节中描述的那些。优选的比对是通过smith-waterman同源搜索算法使用仿射缺口搜索确定的，其中缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为2，blosum矩阵为62。smith-waterman同源搜索算法在参考文献34中公开。

182、“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。必要时，本发明的定义中可以省略“基本上”一词。

183、在此公开的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示为以引用方式并入一样。

184、提供以下实施例来举例说明本发明的各种实施方案。实施例是举例说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明。

185、实施例

186、通过突变经由可裂解接头(/albutrepenonacog alfa，seq idno：10)与重组成熟人白蛋白融合的人野生型fix多肽(seq id no：1)中的一个或两个氨基酸位置产生一系列示例性重组fix变体多肽。重组fix变体在hek细胞中表达，并测试细胞培养上清液或纯化的蛋白的活性和抗原。将活性与抗原的比率与包含野生型fix的相应多肽进行比较。在野生型fix的410和338位具有某些突变的fix变体显示出惊人的高活性，如下所示。

187、实施例1

188、质粒dna的产生、细胞转染和蛋白质表达

189、根据本领域的标准技术产生编码因子ix或因子ix-白蛋白融合多肽(fix-fp)的质粒dna，所述多肽包括野生型或变体fix。成熟的野生型因子ix多肽序列显示在seq id no：1中。示例性因子ix变体多肽序列显示在seq id no：11-14中。特别地，野生型因子ix(seq idno：1)的410位的e(谷氨酸)被h(组氨酸)或k(赖氨酸)取代，和/或)野生型因子ix(seq idno：1)的338位的r(精氨酸)被v(缬氨酸)、w(色氨酸)、t(苏氨酸)或l(赖氨酸)取代。产生了在338位和/或410位处具有突变的单突变体和双突变体。因子ix-fp的接头和白蛋白分别如seq id no 8和9中所定义。然而，可以使用其他接头和半衰期增强部分(如例如参考文献1中所述的)，或者可以省略它们。

190、将质粒dna克隆到pcdna3.1载体中，并在大肠杆菌xl10-gold超感受态细胞(agiland technologies目录号：200315)中扩增。使用标准方案((qiagen plasmid pluspurification目录号：12945，hilden，germany)纯化质粒dna。

191、使用expi293f表达试剂盒(目录号a14635，thermofisher)以250ml规模开始多肽的瞬时生产。收集指数生长期的活expi293tm细胞并相应地在2l摇瓶(corning,lowell,ma)中重新悬浮以获得2.5×106个细胞/ml的起始细胞密度。将质粒dna(125μg)和expifectamintm 293试剂(675μl)分别稀释在12.5mli还原血清培养基中。将稀释的expifectamintm 293试剂和质粒dna等份混合。将混合物添加到expi293tm表达培养基中的225ml的62.5×107个总活细胞。表达培养基中添加了50μg/ml甲萘醌k3(sigma aldrich，steinheim，germany)。在37℃(8％co2,150rpm)的定轨摇床培养箱中孵育培养物。17-20小时后，将作为expi293表达试剂盒的一部分的enhancer i(1.25ml)和enhancer ii(12.5ml)添加到培养物中。在96小时的总培养时间后，使用合适的无菌过滤器收集培养物上清液。然后如实施例2中所解释的那样纯化因子ix蛋白。

192、对于使用细胞培养上清液测量因子ix活性等的实验，fix-fp野生型和fix-fp变体多肽如上所述表达，不同的是培养体积为50ml和来自转染细胞的培养上清液在48小时收集。如下所述(实施例3和4)，因子ix活性在一阶段因子ix特异性凝血测定中评估并且抗原水平用因子ix特异性elisa确定。

193、实施例2

194、蛋白质纯化

195、将含有如上文实施例1中所述的因子ix白蛋白融合多肽、各个因子ix多肽的细胞培养物上清液施加到预先用20mm hepes、50mm nacl和12mmol的ph6.2的edta缓冲液平衡的poros 50hq柱上。随后，用含有20mm hepes、100mm nacl的ph6.2的缓冲液洗涤柱。通过向洗涤缓冲液中加入10mmol cacl2来实现结合的fix融合多肽的洗脱。

196、实施例3

197、因子ix活性和抗原的测定

198、使用商购可得的aptt试剂(sl和fix耗尽血浆，siemenshealthcare)将因子ix活性测定为凝块或凝血活性(fix:c)。使用针对who国际fix浓缩标准校准的内部次级标准品作为参考。

199、根据本领域技术人员已知的标准方案，通过elisa测定因子ix抗原(fix：ag)。简而言之，将微量滴定板与每孔100μl的捕获抗体(用于因子ix elisa的配对抗体(cl20041k)，cedarlane，但也可以应用合适抗体的其他来源)在室温下孵育过夜。用洗涤缓冲液b(sigmat9039)洗涤板3次后，将每个孔与200μl封闭缓冲液c(sigma p3688)在室温下孵育1小时。在用缓冲液b进行另外三个洗涤步骤后，将测试样品在缓冲液b中的系列稀释液以及次级标准品(shp)在缓冲液b中的系列稀释液(每孔体积：100μl)在室温下孵育90分钟。用缓冲液b进行三个洗涤步骤后，将100ml的在缓冲液b中1:200稀释的检测抗体(用于因子ix elisa的配对抗体，过氧化物酶标记的，cedarlane)加入每个孔中，并在室温下再孵育90分钟。用缓冲液b进行三个洗涤步骤后，每孔加入100μl底物溶液(tmb，siemens healthcare，ouvf)，并在室温下避光孵育30分钟。添加100μl未稀释的终止液(siemens healthcare,osfa)制备样品以在合适的酶标仪中以450nm波长读取。然后使用标准曲线以标准人血浆作为参考计算测试样品的浓度。

200、实施例4

201、因子ix变体相对于野生型的因子ix-活性/因子ix-抗原比率的比较

202、如以上实施例3中所述进行因子ix活性和抗原。将因子ix变体比活性标准化至因子ix抗原水平，通过抗因子ix elisa(fix:c与fix:ag的比率)测量以控制实验变异，从而代表与不同构建体的摩尔比活性直接成比例的量度。

203、野生型因子ix(在本实施例中为seq id no：10)的所得活性被指定为值“1”。基于的因子ix变体的活性相对于野生型因子的活性指示。

204、下面的表1和2显示了各种fix-fp变体相对于野生型fix-fp的比活性，使用含有重组表达的蛋白的细胞培养上清液(表1)或使用纯化的蛋白(表2、3和4)测量。

205、表1：因子ix变体相对于野生型因子的比活性，使用上清液测量。

206、 构建体 相对于野生型fix-fp的比活性 fix-fp对照(野生型) 1.00 fix-fp r338v+e410h 7.77 fix-fp r338t+e410h 6.75 fix-fp r338w+e410h 5.32 fix-fp r338l+e410k 5.58 fix-fp e410h 2.03 fix-fp r338v 4.26 fix-fp r338l 4.76 fix-fp r338t 2.55

207、表2：因子ix变体相对于野生型因子ix的比活性，使用纯化的上清液测量(阴离子交换)。

208、 构建体 相对于野生型fix-fp的比活性 fix-fp对照(野生型) 1.00 fix-fp r338v+e410h 7.47 fix-fp r338t+e410h 6.68 fix-fp r338w+e410h 4.02 fix-fp r338l+e410k 5.48 fix-fp e410h 3.38 fix-fp r338v 3.15 fix-fp r338l 4.59

209、表1和表2显示在野生型因子ix的338和/或410位具有某些突变的fix-fp变体产生比野生型fix-fp更高的比活性。此外，在野生型因子ix的338和410位具有某些突变的双突变体(例如r338v+e410h、r338v+e410t)产生比野生型fix-fp和每个相应的单一突变体(例如r338v、r338t、e410h)更高的比活性。事实上，双突变体的活性可以超过相对于各自的单突变体的累加(协同)作用。此外，r338v+e410h、r338t+e410h和r338w+e410h双突变体的比活性高于对应于因子ix“padua”突变体r338l的变体的活性(参见参考文献35)。r338v+e410h和r338t+e410h双突变体的比活性进一步高于对应于“padua”r338l+e410k双突变体的变体的活性。

210、在进一步的实验中，测定如上所述产生的r338l+e410k和r338l+e410h双突变体的比活性，并与相应的r338l单突变体的活性进行比较。下表3显示r338l+e410h双突变体比r338l单突变体具有更高的比活性，该r338l单突变体本身与野生型相比具有更高的比活性(如上表1和2所示)。因此，r338l+e410h双突变体是另一个有用的因子ix变体。

211、表3：fix-fp变体相对于r338l的比活性，使用上清液测量。

212、 构建体 相对于r338l的比活性 fix-fp对照(r338l) 1.00 fix-fp r338l+e410h 2.10 fix-fp r338l+e410k 1.34

213、此外，表3显示e410h突变在掺入双突变体时导致高于相同双突变体中的e410k突变的整体活性。

214、本领域技术人员将理解，本发明仅通过示例的方式进行了描述，并且在保持在本发明的范围和精神内的情况下可以进行修改。

215、表4：因子ix变体相对于野生型因子ix的比活性的比较，使用纯化的上清液测量(阴离子交换)。

216、 构建体 相对于wt-fix的比活性 对照fix-野生型 1.0 fix r338v+e410h 6.48 fix r338t+e410h 8.01

217、表4显示，表达为不与白蛋白融合的因子ix的双突变体r338v+e410h和r338t+e410h的比活性也高于因子ix野生型对照。因此，本发明的因子ix突变的改善的比活性与白蛋白融合无关。

218、参考文献

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254、序列表

255、seq id no:1

256、>人野生型fix多肽

257、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclrstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikektklt

258、seq id no:2

259、>人野生型fix多肽的编码序列

260、atgtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgggttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcacttaa

261、seq id no:3

262、>包含信号肽和前肽的人野生型fix多肽

263、mqrvnmimaespgliticllgyllsaectvfldhenankilnrpkrynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclrstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikektklt

264、seq id no:4

265、>包含信号肽和前肽的人野生型fix多肽的编码序列

266、atgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgggttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcacttaa

267、seq id no:5

268、>人野生型fixa轻链多肽

269、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltr

270、seq id no:6

271、>人野生型fixa重链多肽

272、vvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclrstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikektklt

273、seq id no:7

274、>人野生型fix多肽t148a多态性变体

275、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraeavfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclrstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikektklt

276、seq id no:8

277、>接头

278、pvsqtskltraetvfpdv

279、seq id no:9

280、>成熟人白蛋白

281、dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl

282、seq id no:10

283、>fix(野生型)白蛋白融合体

284、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclrstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikektkltpvsqtskltraetvfpdvdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl

285、seq id no:11

286、>fix变体r338v/e410h

287、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclvstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikhktklt

288、seq id no:12

289、>fix变体r338t/e410h

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291、seq id no:13

292、>fix变体r338w/e410h

293、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclwstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikhktklt

294、seq id no:14

295、>fix变体r338l/e410h

296、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratcllstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikhktklt

297、seq id no:15

298、>fix变体r338v/e410h白蛋白融合体

299、ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvdgdqcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegknceldvtcnikngrceqfcknsadnkvvcsctegyrlaenqkscepavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvggedakpgqfpwqvvlngkvdafcggsivnekwivtaahcvetgvkitvvagehnieetehteqkrnviriiphhnynaainkynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclvstkftiynnmfcagfheggrdscqgdsggphvtevegtsfltgiiswgeecamkgkygiytkvsryvnwikhktkltpvsqtskltraetvfpdvdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl

300、seq id no:16

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303、seq id no:17

304、>人igg1 fc

305、dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg

306、seq id no:18

307、>ctp序列

308、sssskappps

309、seq id no:19

310、>ctp序列

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312、seq id no:20

313、>ctp序列

314、sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq

315、seq id no:21

316、>xten人工序列

317、gaptsesatpesgpgsepatsgsetpgtsesatpesgpgsepatsgsetpgtsesatpesgpgtstepsegsapgass

318、seq id no:22

319、>xten人工序列

320、gapgspagsptsteegtsesatpesgpgsepatsgsetpass