一种木聚糖酶的表达生产工艺的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种木聚糖酶突变体的表达生产工艺。

背景技术：

1、半纤维素是植物体内含量很高的一类生物质，来源十分广泛，是由木聚糖、木葡聚糖和半乳葡萄甘露聚糖构成的多糖混合物。木聚糖是半纤维素的主要成分，是一种复杂的多聚五碳糖，不同植物、同种植物不同生长周期，体内木聚糖的含量也有所差异。低聚木糖是木聚糖降解后最重要的产物，具有多种有益的生物效应，是一种重要的功能物质。低聚木糖可以抑制炎症和调节肠胃微生物群落，可以抗氧化，提高鱼类肠道免疫相关基因的表达，可以促进人肠道内益生细菌双歧杆菌的增值促进消化吸收，可以调节细胞免疫水平具有抗肿瘤等作用。如何高效获取低聚木糖，成为目前研究的热门。

2、低聚木糖的制备方法有传统的热水抽提法、酸水解法和碱水解法，上述理化方法往往存在能耗高、环境压力大、工艺繁琐和对设备要求高等问题。为突破传统制备工艺的不足，酶水解法应运而生，通过生物酶在适宜的条件下将木聚糖水解为低聚木糖和其他糖，当前主要的酶水解技术有复合酶解法、固定化酶水解法等，其中复合酶水解法工艺绿色、环保是当前的主流方法也是目前的研究热点，其中木聚糖酶是水解木聚糖的最主要的功能酶。

3、木聚糖酶是一类能够水解木聚糖释放低聚木糖和木糖的一类酶的总称，包括内切-β-1，4-d-木聚糖酶、外切-β-1，4-d-木聚糖酶和β-木糖苷酶。根据糖苷水解酶的催化结构域氨基酸序列的相似性进行划分，绝大部分木聚糖酶分属糖苷水解酶家族的gh10和gh11家族，近年来也陆续发现一些隶属其他家族的木聚糖酶，如gh5、gh30、gh43等糖苷水解酶家族。当前对于木聚糖酶的研究主要集中在gh10和gh11两个家族中，gh11家族结构较简单，分子量较低，通常不超过20kda，分子结构只有β折叠构成，含有单一的催化结构域，只具有木聚糖酶活性。gh10家族的木聚糖酶一般分子量大于gh11家族的木聚糖酶，分子结构更为复杂，由α螺旋和β折叠两种结构构成，整体结构呈单层碗状结构，其中内部是β折叠形成的碗状，外部为α螺旋。与gh11家族木聚糖酶相比较，gh10家族不止一个催化结构域，可能除了木聚糖酶活性外，还具有其他催化活性，且由于结构更复杂，gh10家族木聚糖酶的结构更稳定，木聚糖酶的热稳定性更好。当前研究热点主要包括寻找高酶活的木聚糖酶，改造酶提高酶活或稳定性，酶的固定化及复合酶高效酶解底物等。对木聚糖酶的改造中，haritboonyaputthikul通过突变增加二硫键，提高了gh11家族的木聚糖酶xyn11a的酶活性；li,yangyang通过分子动力学模拟，突变部分氨基酸，对gh11家族的木聚糖酶xyna的灵活区域进行修饰，显著增强了该酶的热稳定性；李志宏通过基因结构半理性设计和计算机辅助两种策略，对gh11家族的木聚糖酶进行改造，提高了木聚糖酶的热稳定性。在目前发现的木聚糖酶中，gh11家族的木聚糖酶酶活相较gh10家族木聚糖酶酶活高，但也有部分高酶活的gh10木聚糖酶陆续被发现。有学者在宇佐美曲酶就发现了一个gh10家族木聚糖酶，经毕赤酵母外源表达酶活达6267u/mg,经改造后酶活达8870u/mg。但改造后的木聚糖酶热失活半衰期只有72min，不足以满足工业生产要求。

4、因此，有必要在现有技术基础上，寻找具有更高热稳定性的酶突变体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有更高热稳定性的木聚糖酶突变体，所述的木聚糖酶突变体可以用于水解木聚糖释放低聚木糖和木糖。

2、本发明第一方面是提供了一种具有更高热稳定性的木聚糖酶突变体xyn10，所述的木聚糖酶突变体xyn10序列如seq id no：1所示：

3、qasvsidtkfkahgkkylgnigdqyrlttgknaaiikadfgaltpensmkwdatepsrgqfsfsgsdylvnfaqsnnklirghtlvwhsqlpswvqsitdkntlievmknhittvmqhykgkiyawdvvneifnedgslrdsvfykvigedyvriafetaraadpnaklyindynldsasypkltgmvshvkkwiaagipidgigsqthlsagggagisgalnalagagtkeiavteldiagasstdyvevveaclnqpkcigitvwgvadpdswrssstpllfdgnynpkpaytaianalsgsgttttttttstttggtdpt(seq id no：1)

4、本发明提供的木聚糖酶突变体xyn10，通过在野生型木聚糖酶的c端添加了22个氨基酸而得。研究表明，改造后的木聚糖酶，在对温度和对ph的耐受性上均有一定程度的提升，尤其是在热稳定性上更为明显。

5、氨基酸序列分析结果显示，木聚糖酶突变体xyn10酶催化中心为三维结构中由β折叠形成的桶状结构构成，其中第131位和第237位的谷氨酸(e)为催化位点。在不影响木聚糖酶突变体xyn10活性前提下，可对seq id no:1所示的远离催化中心氨基酸位置(优选远离131位谷氨酸(e)和237位谷氨酸(e))的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有木聚糖酶突变体xyn10的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域(优选131位谷氨酸(e)和237位谷氨酸(e)氨基酸位置)的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的木聚糖酶突变体xyn10具有至少与seq id no:1所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

6、同理，本发明还提供了编码如seq id no：1所示氨基酸序列的基因序列，其与seqid no：2所示的核苷酸序列一致。

7、caggcttcagtgagtattgataccaaattcaaggctcacgggaagaaatatcttggaaacattggtgatcagtaccggctgacgaccggcaaga

8、atgcggccattatcaaggccgattttggcgcgttgactccagagaacagcatgaagtgggatgctactgaacccagccgtggacagttctctttct

9、caggatcggactacctggtcaactttgcccagtctaacaacaagctgatccgcggacatactctcgtgtggcactcgcagctcccctcctgggtc

10、caatccatcacggacaagaatacactgatcgaagtcatgaagaatcacatcaccacagtgatgcaacactataagggcaagatttatgcctggg

11、atgttgtcaatgaaatcttcaacgaagacggctccctacgcgacagcgtcttttacaaggtcatcggcgaggactacgtgcggatcgccttcgag

12、actgctcgggctgcagatcccaatgcaaagctctacatcaatgattacaacctggattccgcctcctaccctaaattgaccggcatggttagccat

13、gtcaagaagtggatcgcagctggcatccctatcgatggaatcggttcccaaacccacttgagcgctggtggaggtgctggaatttctggagctct

14、caatgctctcgcaggtgccggcaccaaggagattgctgtcaccgagcttgacatcgctggcgccagctcgaccgactacgtggaggtcgtcga

15、agcctgcctgaaccagcccaagtgtatcggtatcaccgtttggggagttgctgacccggattcctggcgctccagctccactcctctgctgttcga

16、cggcaactacaacccgaagcctgcatacactgctatcgcaaatgctctcagcggctccggcaccacaacgaccactactactacttctactacgacaggaggtacggaccctact(seq id no：2)

17、本发明还提供对seq id no：2所示的核苷酸序列中除391-393和709-711位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留木聚糖酶突变体xyn10蛋白生物学活性的突变体基因。优选的木聚糖酶突变体xyn10基因具有至少与seq id no:2所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

18、利用基因克隆技术，可将克隆到的木聚糖酶突变体xyn10基因序列(seq id no:2)连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组木聚糖酶突变体xyn10(seq id no:1)。合适的原核生物宿主包括各种细菌如e.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用酵母表达系统，更优选毕赤酵母、酿酒酵母和汉森酵母等。目标蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是酵母mfα信号肽。编码目标蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

19、合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pet系列载体，pqe系列载体；真核表达表达载体如ppic系列载体，pgapz系列载体等。一个优选的例子是将本发明筛选到的木聚糖酶突变体xyn10基因序列(seq idno:2)连接到酵母表达载体ppic9h上，并转化到酵母菌gs115中，经诱导表达出高活性的木聚糖酶突变体xyn10。将载体转化至宿主细胞中可用通常的方法，如：电穿孔、制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明dna构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取dna，然后pcr方法鉴定。

20、本发明第二方面是提供了一种具有更高热稳定性的木聚糖酶突变体xyn10的制备方法，包括如下步骤：

21、(a)将携带编码木聚糖酶突变体xyn10基因的重组表达载体导入酵母宿主细胞，在有助于产生目标蛋白的条件下培养重组宿主细胞；和

22、(b)回收所述木聚糖酶突变体xyn10。

23、在本发明的制备方法中，使用本领域已知的方法培养含有本发明dna构建体的宿主，如重组酵母生产本发明的木聚糖酶突变体xyn10。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、ph缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)的生长，第二阶段主要用于诱导表达目标产物。将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵,通过甲醇诱导。将经甲醇诱导后的培养液离心，收集上清液。

24、可以用各种蛋白分离的方法分离纯化木聚糖酶突变体xyn10，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

25、在另一实施方案中，本发明第二方面是提供了一种具有更高热稳定性的木聚糖酶突变体xyn10的制备方法，包括如下步骤：

26、(a)将携带编码木聚糖酶突变体xyn10基因的重组表达载体导入酵母宿主细胞，在有助于产生目标蛋白的条件下培养重组酵母细胞；

27、(b)将酵母培养液离心后收集上清液；

28、(c)上清液通过his亲和层析柱纯化，制备得到木聚糖酶突变体xyn10。

29、在另一实施方案中，所述方法步骤(c)中，所述的his亲和层析柱纯化过程为：先用含10-40mmol/l咪唑，100-400mmol/l nacl，10-40mmol/l tris，ph为7.3-9.0的washbuffer清洗层析柱，洗至层析树脂不带培养基颜色，最后用250-450mmol/l咪唑，100-400mmol/l nacl，10-40mmol/l tris，ph为7.3-9.0为的buffer进行洗脱，得到目标蛋白木聚糖酶突变体xyn10。经测定，所述蛋白的纯度大于90％，更优选纯度大于95％。

30、在另一实施方案中，所述方法步骤(c)中，所述的his亲和层析柱纯化过程为：先用含25-35mmol/l咪唑，150-350mmol/l nacl，25-35mmol/l tris，ph为8.0-9.0的washbuffer清洗层析柱，洗至层析树脂不带培养基颜色，最后用250-350mmol/l咪唑，150-350mmol/l nacl，25-35mmol/ltris，ph为8.0-9.0为的buffer进行洗脱，得到目标蛋白木聚糖酶突变体xyn10。经测定，所述蛋白的纯度大于90％，更优选纯度大于95％。

31、在另一实施方案中，所述方法步骤(c)中，所述的his亲和层析柱纯化过程为：先用含30mmol/l咪唑，300mmol/lnacl，30mmol/l tris，ph为8.5为的wash buffer清洗层析柱，洗至层析树脂不带培养基颜色，最后用300mmol/l咪唑，300mmol/lnacl，30mmol/l tris，ph为8.5为的buffer进行洗脱，得到目标蛋白木聚糖酶突变体xyn10。经测定，所述蛋白的纯度大于90％，更优选纯度大于95％。

32、本发明第三方面是提供了所述具有更高热稳定性的木聚糖酶突变体xyn10的工业应用。

33、本发明还提供了木聚糖酶突变体xyn10在工业上的应用，例如可以用于水解木聚糖释放低聚木糖和木糖。通过酶活力测定表明，将野生型与突变体xyn10木聚糖酶的酶学数据放在同一个图中进行比对，在c端增加了22个氨基酸的突变体，最适温度和最适ph与野生型相同，在其余的温度和ph值处，相对酶活有不同程度的增加。在ph为5.0，温度为50℃的环境下，不同的保温时间下，突变体的相对酶活均高于野生型木聚糖酶。突变体木聚糖酶在最适温度与最适ph下，反应20分钟，酶活为：132u/mg，略高于野生型木聚糖酶酶活128u/mg。

34、本发明获得的木聚糖酶突变体xyn10具有更好的热稳定性，展现了优良的酶学特性，可应用于水解木聚糖释放低聚木糖和木糖生产过程中。获得的木聚糖酶突变体xyn10基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产木聚糖酶突变体xyn10，为后续的工业应用提供成本低廉的木聚糖酶起始材料。木聚糖酶突变体xyn10可在低聚木糖生产中显示出重要的经济和社会价值。