一种助溶标签蛋白及其在制备植物激发子小肽中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种助溶标签蛋白及其在制备植物激发子小肽中的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、农作物生长过程中时刻面临着包括病毒、细菌、真菌、卵菌和线虫等各种病原微生物的侵害。作为防止农作物病虫害的传统方法，化学防治方法所带来的化学农药的过度使用给环境和人类健康造成严重损害，而开发生物农药是减少化学农药使用量的重要手段之一。

3、包括农作物在内的植物自身具有对抗病原微生物的防御机制。来自病原菌的免疫激发子可引发植物的广谱抗病性，又称模式触发免疫(pattern-triggered immunity,pti)。该免疫途径通过膜受体识别病原菌相关分子模式(pathogen-associated molecularpatterns，pamps)激活下游免疫反应，包括重塑转录组和代谢组等，抵抗病原菌侵染。此外，植物可通过识别内源性免疫激发子，激活pti反应。目前被鉴定的植物内源激发子包括寡聚半乳糖醛酸(oligogalacturonides,ogs)、肽类和eatp等，这类分子又被称为损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，damps)。

4、基于上述植物免疫信号分子所开发的生物农药称为植物免疫诱抗剂。植物免疫诱抗剂可以激活植物的免疫系统，提高植物抗病性，同时还激发植物代谢系统，促进植物营养生长，提高作物产量。因此，植物免疫诱抗剂在农业生产中有良好的应用效果。分泌肽是研究最为广泛的一类植物肽信号。植物分泌肽作为一类信号分子在调节植物抗病和生长发育中发挥极其重要的作用。例如，拟南芥pip1小肽能够激活包括免疫基因表达、mapk激活、ros产生、气孔关闭和胼胝质沉积等pti免疫反应，增强拟南芥对病原菌的抗性；screw1小肽通过抑制诱导气孔关闭的关键激酶活性、降低s型阴离子通道活性，促进气孔开放，从而破坏微生物在植物体内富含水的寄生环境，限制病原菌的定殖。因此，制备和生产具有免疫激发作用的植物分泌小肽，从而开发成植物免疫诱抗剂类生物农药具有重要应用潜力。

5、尽管植物激发子小肽在农业生产中具有广阔的应用前景，但其制备方法具有很大局限性。虽然可利用从植物组织提取或化学合成的方法制备植物激发子小肽，但这些方法成本高，效率低。相比之下，微生物异源表达是成本较低、操作方便的蛋白或肽类生物制品制备手段。枯草芽孢杆菌系统具备发酵原料廉价、外源蛋白表达量高、菌株具备生物安全等特点，是农用蛋白或肽类制品制备的优良选择。但是，目前仍缺少利用枯草芽孢杆菌异源表达植物激发子小肽的方法。并且，将植物激发子小肽的前体肽在细菌中进行直接表达面临多种障碍，如密码子偏好性不同，翻译后加工修饰不完善，易形成包涵体等。植物激发子小肽通常需要经过成熟加工才表现出高活性，目前也缺乏对表达后的前体肽进行成熟切割的手段。此外，成熟肽的编码序列长度都非常短，序列结构简单，在体外易降解，且不易被纯化，因此对成熟肽直接进行体外表达和制备很难实现。利用助溶标签进行融合表达是对序列较短的小肽进行表达制备的常用方法，但目前适用于枯草芽孢杆菌系统的助溶标签较为有限，限制了植物激发子小肽的大量制备及其在农业生产中的应用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种助溶标签蛋白及其在制备植物激发子小肽中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供了一种助溶标签蛋白，所述助溶标签蛋白包括由n端到c端依次连接的如seq id no.1所示的氨基酸序列、蛋白酶切位点和纯化标签组成。

4、优选的，所述蛋白酶切位点包括prescission蛋白酶酶切位点、thrombin蛋白酶酶切位点或enterokinase蛋白酶酶切位点，prescission蛋白酶切位点的氨基酸序列为levlfqgp，thrombin蛋白酶切位点的氨基酸序列为lvprgs，enterokinase蛋白酶切位点的氨基酸序列为ddddk。

5、优选的，所述纯化标签包括6×his-tag。

6、进一步优选的，当蛋白酶切位点为prescission蛋白酶酶切位点，纯化标签为6×his-tag时，所述助溶标签蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；

7、当蛋白酶切位点为thrombin蛋白酶酶切位点，纯化标签为6×his-tag时，所述助溶标签蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；

8、当蛋白酶切位点为enterokinase蛋白酶酶切位点，纯化标签为6×his-tag时，所述助溶标签蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

9、第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的助溶标签蛋白的编码基因，当蛋白酶切位点为prescission蛋白酶酶切位点，纯化标签为6×his-tag时，所述助溶标签蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.9所示；

10、当蛋白酶切位点为thrombin蛋白酶酶切位点，纯化标签为6×his-tag时，所述助溶标签蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.10所示；

11、当蛋白酶切位点为enterokinase蛋白酶酶切位点，纯化标签为6×his-tag时，所述助溶标签蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.11所示。

12、第三方面，本发明提供了如第一方面所述的助溶标签蛋白在制备植物激发子小肽中的应用。

13、第四方面，本发明提供了一种植物激发子小肽的制备方法，包括以下步骤：

14、s1、合成如权利要求1-4任一项所述的助溶标签蛋白的编码基因与植物激发子小肽的编码基因；

15、s2、构建所述助溶标签蛋白的编码基因与所述植物激发子小肽的编码基因的融合基因，并构建所述融合基因的表达载体；

16、s3、将所述表达载体转化至枯草芽孢杆菌宿主细胞；

17、s4、培养转化后的宿主细胞，获得助溶标签蛋白和植物激发子小肽的融合蛋白；

18、s5、表达液经离心去除菌体，上清液经硫酸铵沉淀、复溶，利用纯化标签进行纯化；将纯化蛋白经蛋白酶进行酶切处理；将酶切处理液经超滤离心进行分离。

19、优选的，所述表达载体包括pht43。

20、第五方面，本发明提供了一种融合蛋白，由如第一方面所述的助溶标签蛋白和植物激发子小肽融合组成。

21、第六方面，本发明提供了一种如第五方面所述的融合蛋白的编码基因，由如第五方面所述的助溶标签蛋白的编码基因和植物激发子小肽的编码基因组成。

22、上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

23、本发明的助溶标签蛋白，在枯草芽孢杆菌宿主中表达稳定，表达量高，且根据三维结构预测，其c端位于蛋白质表面并向外伸展，适合于融合表达小肽。将标签蛋白与植物激发子小肽进行融合表达，可避免植物激发子小肽在外源表达过程中转录、翻译过程中的障碍，并增强小肽的稳定性。

24、本发明所提供的植物激发子小肽的制备方法中产物分泌于培养基上清中，且带有纯化标签，制备简单易行，且所采用的枯草芽孢杆菌为酶制剂生产常用宿主菌株，生产工艺成熟，成本低，具有较好的产业化应用前景。

25、本发明所提供方法所制备的植物激发子小肽atpip1和atscrew1，能够诱导拟南芥mapk磷酸化，证明具有激活拟南芥免疫反应活性。