一种绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺的制作方法

本发明涉及生物工程，具体为一种绿色环保的5’-胞苷酸提取工艺。

背景技术：

1、5’-胞苷酸在常温常压为细灰宝色结晶粉末，可用作食品添加剂，也可用作核苷酸类药物的原料、反应合成的中间体，如用于合成三磷酸胞苷(ctp)、阿拉胞苷(ara-c)、胞二磷胆碱(cdp-choline)等，用途十分广泛。

2、目前胞苷酸的生产方法有化学合成法、生物法两种。化学法合成法常以三氯氧磷为磷酸供体，在有机溶剂中反应，如专利cn104163842a，以胞苷、磷酸三乙酯、吡啶为原料，在-15～5℃下缓慢加入一定量的三氯氧磷，再进行水解、碱中和、脱色、结晶、过滤得到成品，整个制备过程路线长，反应条件要求苛刻，同时三氯氧磷属于剧毒品，中和后产生大量的氯化钠，对环境危害较大，不属于绿色生产。

3、常用的生物法如下三种：(1)利用核糖核酸(rna)的降解来生产5’-胞苷酸，但该方法一次获得4种产物，除了5’-胞苷酸外，其他三种均为反应的副产物，需要经过进一步的分离纯化才能获得纯的5’-胞苷酸；而且该降解rna生产5’-胞苷酸工艺中的分离操作复杂，目标产物收率较低。(2)直接发酵法，如专利cn113999271a提供一种从微生物发酵液中提取5’-胞苷酸的方法，先发酵产出胞苷酸再进行提取，但产酸量较低仅为30g/l，提取5’-胞苷酸时需要使用大量乙醇。(3)酶解法，如专利cn111269870a披露了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用，仅是小试，酶解浓度是30～35mmol胞苷，也就是7.3～9.7g/l，含量低，也未涉及到后续的提取工艺。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种绿色环保的5’-胞苷酸提取工艺，没有使用有毒物质以及有机溶剂，通过简单的沉淀分离即可分离出大部分的磷酸盐，提取收率达到85％以上，产品纯度达到99％。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种绿色环保的5’-胞苷酸提取工艺，包括：

4、s1：调节胞苷酸酶解液的ph至3～5，加热至70～90℃，维持30～35min，使蛋白变性，得灭活物料；

5、s2：将灭活物料用5～50kd的陶瓷膜过滤，去除菌体碎片和变性蛋白，并对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗，得陶瓷膜清液；

6、s3：将陶瓷膜清液用反渗透膜或1000分子量以下的纳滤膜进行浓缩，浓缩至胞苷酸含量100～200g/l，得浓缩液；浓缩出水用于步骤s1中物料的溶解；

7、s4：向浓缩液中加入钙盐，并搅拌30～45min，生成磷酸钙沉淀，得沉淀溶液；

8、s5：分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀，得脱盐清液；

9、s6：调节脱盐清液ph至4～5，然后过滤，将残留的钙盐沉淀去除，得过滤清液；

10、s7：进一步缓慢调节ph至2～3，搅拌结晶5.5～6.5h，将5’-胞苷酸沉淀，得到结晶液；

11、s8：将结晶液使用离心机分离，得5’-胞苷酸粗品；

12、s9：5’-胞苷酸粗品淘洗后，真空干燥即得成品。

13、进一步地，制备步骤s1中胞苷酸酶解液的方法为：取胞苷300～400mmol、多聚磷酸钠60～80mmol、atp 10mmol、镁盐60～90mmol、磷酸二氢钠10mmol、磷酸氢二钠10mmol，混合后加入900ml水溶解，配置成1l的体系，混合均匀后加入尿苷胞苷激酶、聚磷酸激酶酶解反应2～6h。

14、进一步地，所述步骤s2中，对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗时，用水量为胞苷酸酶解液体积的50～70％。

15、进一步地，所述步骤s4中的钙盐为氢氧化钙或氯化钙，添加量为320～440mmol/l。

16、进一步地，所述步骤s5中采用板框过滤或抽滤的方法分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀；步骤s6中的过滤采用板框过滤或抽滤。

17、进一步地，所述步骤s1和步骤s6均使用硫酸调节ph值；步骤s7中用盐酸调节ph值。

18、进一步地，所述步骤s9中淘洗的具体工序为：将5’-胞苷酸粗品用温度为10～30℃的纯水淘洗，淘洗时间为1～2h，纯水的使用量为5’-胞苷酸粗品的2～3倍，分离得到5’-胞苷酸湿成品，用双锥或者耙式真空干燥后得到成品。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、(1)本发明使用酶解的物料提取5’-胞苷酸，酶解后胞苷酸含量达到100g/l，整个过程为生物法，没有使用有毒物质以及有机溶剂，通过简单的沉淀分离即可分离出大部分的磷酸盐，然后通硫酸沉淀分离剩余的钙盐，取代大量的离子交换和色谱脱盐的使用，极大的减少了污水的排放，提取收率达到85％以上，产品纯度达到99％，是一种绿色环保的提取工艺。

21、(2)本发明使用硫酸沉淀剩余的钙盐，在ph为4～5时，胞苷酸不沉淀，可有效分离剩余的钙盐。

22、(3)本发明在纯化5’-胞苷酸时，利用溶解度的差异，使用淘洗进一步的提纯，使得最后得到的5’-胞苷酸纯度达99％以上。

技术特征：

1.一种绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，制备步骤s1中胞苷酸酶解液的方法为：取胞苷300～400mmol、多聚磷酸钠60～80mmol、atp 10mmol、镁盐60～90mmol、磷酸二氢钠10mmol、磷酸氢二钠10mmol，混合后加入900ml水溶解，配置成1l的体系，混合均匀后加入尿苷胞苷激酶、聚磷酸激酶酶解反应2～6h。

3.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤s2中，对去除的菌体碎片和变性蛋白进行清洗时，用水量为胞苷酸酶解液体积的50～70％。

4.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤s4中的钙盐为氢氧化钙或氯化钙，添加量为320～440mmol/l。

5.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤s5中采用板框过滤或抽滤的方法分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀；步骤s6中的过滤采用板框过滤或抽滤。

6.根据权利要求1所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤s1和步骤s6均使用硫酸调节ph值；步骤s7中用盐酸调节ph值。

7.根据权利要求1～6任一项所述的绿色环保的5'-胞苷酸提取工艺，其特征在于，所述步骤s9中淘洗的具体工序为：将5'-胞苷酸粗品用温度为10～30℃的纯水淘洗，淘洗时间为1～2h，纯水的使用量为5'-胞苷酸粗品的2～3倍，分离得到5'-胞苷酸湿成品，用双锥或者耙式真空干燥后得到成品。

技术总结
本发明公开了一种绿色环保的5'‑胞苷酸提取工艺，涉及生物工程技术领域，包括：使胞苷酸酶解液中的蛋白变性，得灭活物料；将灭活物料过滤后浓缩，浓缩至胞苷酸含量100～200g/L；向浓缩液中加入钙盐，并搅拌30～45min，得沉淀溶液；分离沉淀溶液中的磷酸钙沉淀，得脱盐清液；调节脱盐清液pH至4～5，然后过滤，将残留的钙盐去除，得过滤清液；缓慢调节pH至2～3，搅拌结晶5.5～6.5h，得到结晶液；将结晶液使用离心机分离，得5'‑胞苷酸粗品；5'‑胞苷酸粗品淘洗后，真空干燥即得成品。本发明为生物法，没有使用有毒物质以及有机溶剂，通过简单的沉淀分离即可分离出磷酸盐，取代大量的离子交换和色谱脱盐的使用，产品纯度达到99％，是一种绿色环保的提取工艺。

技术研发人员：金祥,王海雷,秦小武,李耀辉
受保护的技术使用者：陕西量维生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11