CD24抗体偶联药物及其制备方法、应用

本发明属于生物，具体涉及cd24抗体偶联药物及其制备方法、应用。

背景技术：

1、三阴性乳腺癌是指雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)及人表皮生长因子受体2(her-2)均为阴性的乳腺癌亚型，该类型乳腺癌具备肿瘤侵袭性较强，易发生局部复发及远端转移，患者生存期较短且预后较差等特征。根据who在2020年统计的数据，乳腺癌新增人数高达226万，超越肺癌，正式成为全球最常见癌症。其中，三阴性乳腺癌占比约10～15％，与其他类型乳腺癌相比，三阴性乳腺癌高侵袭性、复发性和死亡率的特点，使得针对其的治疗手段大大受限，主要分为手术切除、放疗、化疗(紫杉醇、蒽环类、铂等)与靶向治疗(免疫检查点抑制剂、parp抑制剂、pi3k/akt/mtor抑制剂等)。目前，化疗仍然是治疗三阴性乳腺癌的主要手段，但随着新靶点、机制的发现，新兴的靶向治疗方式(adc、car-t等)可能成为tnbc治疗前景可观的突破口。

2、cd24是一种高度糖基化的蛋白，通过gpi锚定在细胞表面，它广泛表达于乳腺癌、卵巢癌多种实体肿瘤中，并参与介导肿瘤发生和发展的信号转导。cd24通过与肿瘤相关巨噬细胞表达的抑制性受体唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素10(siglec-10)的相互作用，从而释放“别吃我”信号来抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，达到免疫逃避的目的。有研究表明cd24在乳腺癌等癌症中，可能是占主导地位的先天免疫检查点。而在三阴性乳腺癌(tnbc)中cd24表达显著高于健康乳腺细胞或雌激素受体和孕激素受体阳性(er+pr+)的乳腺癌细胞。这为以cd24为靶点设计针对三阴性乳腺癌的新型靶向药物提供了可行性。临床前研究显示使用单克隆抗体阻断cd24与siglec-10的相互作用，能够恢复肿瘤相关巨噬细胞(tam)的吞噬作用，从而杀伤肿瘤，靶向tnbc表面cd24的单克隆抗体能够有效抑制肿瘤的发展和转移。

3、一氧化氮(nitric oxide)是一种亲脂性、易扩散的气体分子，调节着多种生物学功能，并介导细胞内外的多种信号转导。在肿瘤的发生发展过程中，no根据来源与浓度的不同而发挥着双重作用。在肿瘤微环境中，高水平no可以发挥抗肿瘤作用，诱导癌细胞凋亡。目前报道的no对肿瘤细胞作用机制主要有以下几个方面：第一，高浓度no诱导对细胞内关键蛋白的翻译后修饰；第二，高浓度no可以使细胞色素c的亚铁血红素发生亚硝基化，亚硝基化的细胞色素c可以进一步导致caspase-3的激活增强从而最终诱导肿瘤细胞凋亡；第三，no可以在细胞内与超氧阴离子(o2—)反应形成的过氧化物亚硝酸盐(onoo—)造成肿瘤细胞dna的氧化性损伤。因此，利用一氧化氮供体药物(nitric oxide donor)向肿瘤细胞递送高浓度no，能够通过诱导蛋白亚硝基化、生成过氧亚硝酸盐等途径造成肿瘤杀伤。设计和研究no供体药物已成为近年来抗肿瘤药物创新的重要策略之一，而受到美国国立癌症研究所(nci)以及一些世界知名医药企业如merk、pfizer、nicox、nitromed等的投资支持。

4、基于以上发现，中国药科大学抗体工程实验室与新药研究中心合作开发了第一代鼠源抗体g7mab与一氧化氮供体二乙胺偶氮鎓二醇盐分子的偶联物anc(antibody no-donor conjugate)分子hn-01(cn108404138a)。该偶联物在体内外实验中都表现出较好的抑瘤活性，但其随机偶联方式使得产物均一性较差，在体外给药后造成荷瘤小鼠体重下降较快。因此，两实验又优化偶联方式，合作开发了第二代采用定点突变改造的抗cd24嵌合抗体tg7与一氧化氮供体二乙胺偶氮鎓二醇盐分子定点偶联物hn-02(cn112592406a)，该偶联物均一性、稳定性均得到有效提升，并且相较于第一代anc显著延长小鼠生存期，但依然存在肿瘤微环境中选择性释放no情况不佳，抗体-药物偶联比(dar)较低等问题有待优化。

技术实现思路

1、基于先前研究，本发明设计出一种利于三阴乳腺癌治疗的生物正交催化型anti-cd24抗体-no偶联药物hn03，其有效提高对于高表达cd24的三阴乳腺癌的选择性，并且在体内外实验中均发现对于包括较为难治tnbc在内的乳腺癌细胞具有良好的杀伤效果。

2、发明目的

3、本发明的目的在于基于前两代anc分子的开发，提供一种新型pt(ⅳ)介导的生物正交催化型αcd24-no供体偶联物的制备过程，即第三代anc分子hn03，该偶联物提升了抗体-药物偶联比，并优化了对于肿瘤微环境的选择性，具有抗三阴性乳腺癌及高表达cd24的其他乳腺癌效果，为adc药物的弹头分子设计及三阴乳腺癌的治疗提供了新思路。

4、本发明的第一方面，提供一种工程化改造半胱氨酸位点的αcd24单克隆抗体序列及制备方法，命名为cg7-sv；

5、本发明的第二方面，提供一种基于pt(ⅳ)介导的生物正交前体药物弹头分子，即带有马来酰亚胺与pt(ⅳ)linker的no供体的制备方法，命名为s；

6、本发明的第三方面，提供一种αcd24单克隆抗体cg7-sv与基于pt(ⅳ)介导的生物正交前体药物弹头分子s相偶联，制备新型抗体-药物偶联物的方法，该偶联产物命名为hn03。

7、技术方案

8、本发明涉及cd24抗体偶联药物hn03为定点突变的嵌合抗体cg7-sv和带有pt(ⅳ)linker的丙炔基保护的no供体二醇二氮烯鎓通过马来酰亚胺与抗体半胱氨酸间的加成反应偶联而成，可以同时发挥抗体cg7-sv的cd24靶向性和一氧化氮供体二醇二氮烯鎓的肿瘤微环境依赖性细胞毒性，在体内外均可以抑制cd24阳性的三阴乳腺癌细胞mda-mb-468和过表达cd24的小鼠乳腺癌细胞emt-6-hcd24的增殖。

9、具体而言：

10、cd24抗体与基于pt(ⅳ)介导的生物正交催化型no供体的定点偶联物hn03，其特征在于：通过对抗cd24单克隆抗体cg7进行moe模拟分析，选择将抗体轻链211位缬氨酸与重链239位丝氨酸突变为为半胱氨酸，使活性巯基被暴露，获得定点突变抗cd24单克隆抗体cg7-sv；再以cg7-sv抗体和一氧化氮供体为基础，通过特定化学偶联工艺，利用含有马来酰亚胺环和pt(ⅳ)的linker将一氧化氮供体分子和突变抗体定点连接起来，形成抗体一氧化氮偶联物；所述的linker中pt(ⅳ)与马来酰亚胺环通过酯键相连，并同样通过酯键与一氧化氮供体相连，在还原性物质的催化下，酯键可被还原而释放pt；所述的一氧化氮供体二醇二氮烯鎓受到丙炔基保护，从而保持较为稳定的结构，在pt的催化下丙炔基脱落，则会自发释放一氧化氮；所述的定点突变抗cd24嵌合抗体的重链氨基酸序列表为seq id no.1～4和seqid no.9，其轻链氨基酸序列表为seq id no.5～8和seq id no.10。

11、一种化合物s，该化合物由丙炔基保护的二醇二氮烯鎓与氧化顺铂、马来酰亚胺环反应制得，其结构如下：

12、

13、所述的化合物s的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

14、

15、步骤一(化合物3的合成)：取4gn-boc哌嗪偶氮鎓(14.9mmol)、十五冠五醚(0.149mmol)和25ml dmf加入到100ml两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并通入氮气保护，然后取2.22ml溴丙炔(29.8mmol)缓缓滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下反应0.5h，然后将反应液移至室温继续反应12h。通过旋蒸除去dmf，剩余物制砂，柱层析得到黄色固体3。

16、步骤二(化合物4的合成)：取1g(3.52mmol)化合物3溶解于10ml二氯甲烷中，加入3ml的二氯甲烷,室温搅拌2h后加入饱和碳酸氢钠溶液至ph为8。饱和氯化钠溶液洗三遍，收集有机层，干燥，浓缩得到化合物4。

17、步骤三(化合物5的合成)：取1.1mg化合物4(5.97mmol)溶解于40ml二氯甲烷中，加入1208mg的三乙胺(11.9mmol),室温搅拌15mins后加入1.2g的丁二酸酐(11.94mmol)，常温搅拌过夜。后处理，反应液浓缩后柱层析得到黄色固体产物5。

18、步骤四(化合物6的合成)：取100mg化合物5(0.175mmol)于单颈反应瓶中，加入21.9mgnhs(0.19mmol)，39.2mg的dcc(0.19mmol)，并加入3ml的dcm溶解，反应液在室温下搅拌30mins。然后，过滤收集滤液，浓缩除去dcm，剩余物制砂，柱层析得到目标产物6，无需纯化直接投下一步。

19、步骤五(化合物s的合成)：取100mg化合物6于单颈反应瓶中，加入83mg氧化顺铂，用3ml的dmso溶解，反应液在75℃，n2保护，避光搅拌5h。反应完全后，过滤得黄色滤液。然后，向反应瓶中加入0.262μmol的羧基部分，以及0.262μmol tbtu和tea，反应液在避光条件下常温继续反应过夜。后处理，加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取三遍。有机层溶液无水硫酸钠干燥后制砂，柱层析得到可供偶联的带有马来酰亚胺linker的目标产物s。

20、该化合物的分子式为c27h44cl2n8o10pt,化学名称为(z)-二氨基(4-((8-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)辛基)氨基)-4-氧代丁酰基)氧基)(4-(4-(1-氧化-2-(丙-2-炔-1-基)二氮烯-1-基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酰基)氧化基)氯化铂(vi)

21、所述的方法，其特征在于：步骤二、步骤三采用二氯甲烷作为溶剂，步骤五中采用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗，无水na2so4干燥和浓缩柱层析的方法来纯化反应产物。

22、一种化学偶联方法，将s分子偶联到抗cd24嵌合抗体轻链211位与重链239位呈还原状态的半胱氨酸巯基上。

23、

24、一种由抗cd24嵌合抗体cg7-sv与s分子制备而成的抗体药物偶联物hn03，其制备方法包括如下步骤：

25、步骤一：定点突变的抗cd24嵌合抗体cg7-sv经过proteina柱亲和层析纯化和葡糖凝胶g25ff脱盐柱分子筛层析替换抗体溶液体系后，bca法测定抗体浓度，加入10倍抗体摩尔量的tcep，在37℃下避光60rpm振摇反应1h。

26、步骤二：通过10kd超滤管在5000rpm,4℃条件下30min超滤浓缩，待超滤管的内液体积低于500ul时，加入pbs溶液，重复一遍以上操作，最后收集超滤管内液。

27、步骤三：将上一步收集的超滤液计算损失后加入12倍抗体摩尔量的dhaa，在27℃下避光60rpm振摇反应4h。

28、步骤四：用50kd的超滤管5000rpm,4℃条件下15min超滤浓缩，待超滤管的内液体积低于500ul时，加入pbs溶液，重复一遍以上操作，将最后收集的超滤液计算损失后，缓慢搅拌加入10倍抗体摩尔量s小分子，在27℃下避光60rpm振摇反应1h。

29、步骤五：用50kd的超滤管5000rpm,4℃条件下超滤浓缩，并用pbs溶液清洗两次，获得hn03。对以上每一步的反应产物留样后，通过sds-page来检测每一个反应产物的电泳条带变化及最终产物hn03的分子量，并用bca试剂盒来测定最终的hn03溶液浓度，置于-80℃保存。

30、定点突变的抗cd24嵌合抗体与pt(ⅳ)介导的生物正交催化型no供体偶联物hn03的应用方式：利用cd24嵌合抗体cg7-sv的靶向作用，使hn03在肿瘤部位富集，在抗原抗体复合物的内化作用下进入肿瘤内部，四价铂被肿瘤微环境中的还原型谷胱甘肽(gsh)等物质还原为二价铂，同时催化no供体药物中保护二醇二氮烯鎓主体的丙炔基剪切脱落，二醇二氮烯鎓因其自身的不稳定性而自发释放高浓度一氧化氮(no)，发挥细胞毒性与肿瘤抑制作用。

31、定点突变的抗cd24嵌合抗体与pt(ⅳ)介导的生物正交催化型no供体偶联物hn03在治疗三阴乳腺癌中的应用。

32、有益效果

33、本发明合成全新结构的化合物s和全新的定点突变抗cd24嵌合抗体cg7-sv，其中s由丙炔基保护的一氧化氮供体二醇二氮烯鎓和马来酰亚胺-pt(ⅳ)linker构成。抗cd24抗体cg7-sv是通过将人源化改造后的嵌合抗体cg7，经过moe模拟选择以及轻链211位缬氨酸、重链239位丝氨酸定点突变为半胱氨酸而合成。两个全新结构的化合物经过反应形成全新结构的抗体药物偶联物hn03。

34、具体如下：

35、本发明中发挥抗体药物偶联物靶向作用的抗cd24抗体cg7-sv是通过将人源化改造后的嵌合抗体cg7，经过moe模拟选择以及轻链211位缬氨酸、重链239位丝氨酸定点突变为半胱氨酸而合成。本发明以s作为偶联细胞毒素，s由丙炔基保护的一氧化氮供体二醇二氮烯鎓和马来酰亚胺-pt(ⅳ)linker构成，具有以下几个特性：(1)l抗体药物偶联比为4，即每个分子裂解后可释放4分子的no；(2)s的一端是马来酰亚胺结构，可与抗体上的半胱氨酸巯基发生加成反应形成硫醚键；(3)s的linker部分包括pt(ⅳ)结构，通过酯键与两边连接，酯键可被还原而断裂，从而释放出pt(ⅳ)；(4)s的一氧化氮供体部分受到丙炔基保护，而在循环中可以保持相对稳定，而pt(ⅳ)能够通过生物正交催化丙炔基脱落，间接促进二醇二氮烯鎓释放高浓度no。研究表明，在相对低氧的肿瘤细胞中，还原性物质谷胱甘肽(glutamine，gsh)等的浓度远高于正常细胞，能够有效还原连接pt(ⅳ)的酯键，从而催化no的释放。本发明采用的化学偶联工艺，是利用还原剂tcep还原抗体链间二硫键、暴露的天然半胱氨酸巯基和突变获得的半胱氨酸巯基，再用dhaa(去氢抗坏血酸)将链间二硫键与天然巯基位点复氧化，只保留突变改造获得的半胱氨酸巯基，之后利用巯基与s上的马来酰亚胺环发生加成反应，形成硫醚键，获得一氧化氮供体与抗体的定点偶联物hn03，稳定抗体药物偶联比为4，产物均一，质量可控。如图1所示，hn03被肿瘤细胞内吞，在胞内gsh等还原性物质的作用下liker断裂可释放活性效应分子no，具体释放机理如下所示：

36、本发明利用cd24抗体的靶向作用，使hn03在肿瘤部位富集，在抗原抗体复合物的内化作用下进入肿瘤内部，四价铂被微环境中的还原型谷胱甘肽(gsh)等物质还原为二价铂，同时催化no供体药物中保护二醇二氮烯鎓主体的丙炔基剪切脱落，自发释放高浓度一氧化氮(no)，发挥细胞毒性与肿瘤杀伤作用。