融合蛋白LSDV090-133及其在检测牛结节性皮肤病病毒抗体中的应用

本发明属于分子生物学领域，具体涉及人工合成的融合蛋白lsdv090-133及其在鉴定牛结节性皮肤病病毒抗体中的应用。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease,lsd)是由牛结节性皮肤病病毒((lumpyskin disease virus,lsdv)引起的一种牛传染病。lsd的发病率在5％-45％，死亡率约为5％，严重时可高达20％。lsdv划分为痘病毒科(poxviridae)山羊痘病毒属(capripoxvirus，capv)的成员之一，双股dna病毒，具有囊膜，基因组较大，包含156个假定基因，血清型单一。

2、lsdv与同属的绵羊、山羊痘病毒的核苷酸序列相似性高达97％以上，抗原相似度高，因此我国使用皮内注射5倍剂量的山羊痘弱毒疫苗接种预防lsd。

3、目前临床上使用山羊痘弱毒活疫苗防控牛结节性皮肤病，血清学上很难将痘病毒属内的各病毒成员加以区分，因此亟需研发血清抗体试剂盒鉴别诊断野毒感染或是疫苗免疫，以便及时发现和淘汰感染牛、尽快控制疫情。因此，开发敏感性好、特异性强的鉴别牛结节性皮肤病病毒感染血清和山羊痘弱毒免疫血清的试剂盒显得异常重要。

4、针对上述问题，申请人在cn 116751264 a中，公开了一种牛结节性皮肤病病毒特异性多片段串联融合蛋白用于鉴定自然感染和疫苗免疫的血清。而在本发明，申请人利用噬菌体展示文库筛选感染血清中的特异性多肽和蛋白免疫印迹试验结合质谱检测的方式，多途径发掘又获得了新的可用于牛结节性皮肤病病毒抗体检测的融合蛋白，为这一检测试剂领域新的补充手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了检测牛结节性皮肤病病毒抗体的融合蛋白lsdv090-133，所述的融合蛋白为seq id no.2所示。

2、本发明的另一个目的在于提供了融合蛋白lsdv090-133在检测牛结节性皮肤病病毒抗体中的应用。

3、本发明还有一个目的在于提供了融合蛋白lsdv090-133在区分牛结节性皮肤病病毒感染血清和山羊痘弱毒疫苗免疫血清中的应用。

4、为实现上述目的，申请人采用以下技术措施：

5、利用噬菌体展示文库筛选牛结节性皮肤病的感染血清和经山羊痘弱毒疫苗免疫后血清的特异性多肽，经生物信息学分析，选取针对牛结节性皮肤病感染血清特有的多肽，包括噬菌体展示文库筛选得到的lsdv090基因编码蛋白的1条特异性多肽和lsdv133基因编码蛋白的2条特异性多肽，同时，申请人利用感染血清，以及不同时期的免疫血清(0dpi、15dpi、30dpi、45dpi和60dpi)分别进行孵育gtpv av41病毒粒子，分析wb出现的差异条带，切胶送公司质谱分析，筛选具有免疫原性或潜在具有鉴别诊断的新靶标，获得了一系列靶标蛋白序列，其中有两个靶标蛋白序列与上述lsdv090基因编码蛋白和lsdv133基因编码蛋白高度同源，因此申请人确定lsdv090基因编码蛋白的1条特异性多肽和lsdv133基因编码蛋白的2条特异性多肽为目的特异性多肽，申请人利用柔性肽将上述3条多肽进行连接，构建的融合蛋白为seq id no.2所示。

6、编码融合蛋白lsdv090-133的基因，也属于本发明的保护范围。

7、表达上述蛋白的方法，包括：将密码子优化后的编码融合蛋白lsdv090-133的多核苷酸(seq id no.1所示)，克隆至pet28a载体，获得连接有目的基因的重组质粒pet28a-lsdv090-133，将构建的pet28a-lsdv090-133质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞用于表达蛋白。

8、本发明的保护范围还包括：

9、融合蛋白lsdv090-133在制备检测牛结节性皮肤病病毒抗体试剂盒中的应用。

10、融合蛋白lsdv090-133在制备区分牛结节性皮肤病病毒感染血清和山羊痘弱毒疫苗免疫血清试剂盒中的应用。

11、一种用于牛结节性皮肤病诊断的试剂盒，所述试剂盒包括融合蛋白lsdv090-133。

12、以上所述的试剂盒，优选的，为间接elisa诊断试剂盒；

13、以上所述的elisa诊断试剂盒，优选地，所述融合蛋白的包被浓度是4μg/ml，所述血清样品的稀释倍数是1：800(体积)。

14、以上试剂盒在非诊断性检测中应用时，结果判定如下：

15、p/n＞2.1，则结果为阳性。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

17、本发明首次通过利用噬菌体展示文库筛选牛结节性皮肤病的感染血清和经山羊痘弱毒疫苗免疫后血清的特异性多肽，经生物信息学分析，选取牛结节性皮肤病感染血清特有的多肽，并利用柔性肽串联技术得到一种能特异性区分疫苗免疫和自然感染的融合蛋白，并验证了该蛋白与lsdv感染血清有很高的反应原性。

18、本发明基于上述融合蛋白，组装了间接elisa检测试剂盒，试剂盒中的lsdv090-133蛋白包被浓度为4μg/ml，血清稀释比为1：800；最佳蛋白包被条件：37℃1h；确定酶标抗体稀释度是1：8000；最佳封闭液：1％(w/v)鱼明胶；最佳封闭液作用时间是2h；确定显色时间是37℃10min；诊断敏感性为100％(95％ci:47.8％-100.0％)，诊断特异性为96.67％(95％ci:83.33％-99.83％)。

技术特征：

1. 一种人工合成的融合蛋白lsdv090-133，所述的融合蛋白为seq id no.2所示。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

3. 根据权利要求2所述的基因，其为seq id no.1所示。

4. 一种原核表达权利要求1所述蛋白的方法，包括：将seq id no.1所示基因克隆至pet28a载体，获得连接有目的基因的重组质粒pet28a-lsdv090-133，将构建的pet28a-lsdv090-133质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞用于表达蛋白。

5.权利要求1所述的融合蛋白lsdv090-133在制备检测牛结节性皮肤病病毒感染抗体试剂盒中的应用。

6.权利要求1所述的融合蛋白lsdv090-133在制备区分牛结节性皮肤病病毒感染血清和山羊痘弱毒疫苗免疫血清试剂盒中的应用。

7.一种用于牛结节性皮肤病诊断的试剂盒，所述试剂盒包括融合蛋白lsdv090-133。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为间接elisa诊断试剂盒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，试剂盒中融合蛋白的包被浓度是4µg/ml，血清样品的稀释倍数是1：800体积比。

10. 权利要求7所述的试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于，检测方法的判定标准是： p/n＞2.1，则结果为阳性。

技术总结
本发明属于分子生物学领域，公开了融合蛋白LSDV090‑133及其在检测牛结节性皮肤病病毒（LSDV）感染抗体和鉴别疫苗免疫抗体中的应用。本发明利用噬菌体展示文库筛选针对牛结节性皮肤病病毒感染血清和山羊痘弱毒疫苗免疫血清的特异性多肽，经生物信息学分析，选取牛结节性皮肤病病毒感染血清特有的3条多肽，通过柔性肽串联至pET28a载体，送公司进行基因合成，原核表达得到LSDV090‑133融合蛋白，分子量约为20 kDa。经验证，该蛋白与LSDV感染牛阳性血清有很强的反应原性，其灰度值明显强于与山羊痘弱毒疫苗免疫60dpi后的免疫血清，是一种潜在的鉴别诊断新靶标，能用于鉴别诊断LSDV感染和山羊痘弱毒疫苗免疫的抗体反应，为牛结节性皮肤病的血清学诊断和防控提供参考工具。

技术研发人员：郭爱珍,袁歆玮,陶攀,董俊花,张谦,项志杰,胡长敏,陈颖钰,陈建国,陈曦
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12