一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用

本发明涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、2’-脱氧腺苷作为脱氧核糖核苷的一种，参与了几乎参与所有生物细胞的遗传信息的传递，影响着蛋白质的合成以及多糖的代谢，并对生物体内细胞的生长、增殖、分化和抑制等具有十分重要的调控作用。它不但是基因药物与基因工程研究的重要原材料，而且它还自身具有很好的生理活性，2’-脱氧腺苷可抑制由糖诱导的胰岛素释放，并且能够降低特异性磷酸二脂酶抑制剂或腺苷环化酶激活剂对于胰岛素分泌的促进作用。此外，2’-脱氧腺苷还可作为抗病毒、抗癌、抗艾滋病药物的重要中间体。

2、目前合成2’-脱氧腺苷的方法有水解法、化学合成法和生物催化法。水解法通过水解含有dna的原料来制备2’-脱氧腺苷，该方法具有原料供应不稳定和分离过程复杂的缺点。化学合成法以腺苷为底物经酯化，酰化剂和缚酸剂的酰化作用，再通过还原和纯化处理得到2’-脱氧腺苷，其缺点为对设备的要求高，产率较低、反应步骤繁琐，反应条件苛刻，且反应时间较长。目前报导的生物催化法以腺嘌呤为前体物，过表达嘌呤核苷磷酸化酶（ deod）、尿苷磷酸化酶（ udp）和硫脒磷酸化酶（ deoa）基因，实现了2’-脱氧腺苷的合成，该方法的缺点为前体物价格昂贵，产量普遍很低，存在耗时长、产率低等问题，很难实现工业化生产。

3、微生物发酵法已经被作为大多数天然小分子产物大规模生产的主流方式，因此，构建一株遗传背景清晰、产量较为可观的2’-脱氧腺苷生产菌株是目前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌。

2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的构建方法。

3、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用。

4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

5、一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，为菌株dar-09，是通过下述基因改造方法获得的：首先通过在出发菌株 e.coliw3110的基因组 yjiv位点引入异源的 b.subtilis168菌株嘌呤操纵子基因 pur( ekbcsqlfmnhd)，由ptrc启动子启动，得到菌株dar-01；然后在基因组 yghx、ygay位点引入异源的 b. subtilis168菌株腺苷酸琥珀酸合酶基因 pura和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因 purb，分别由pt7启动子、ptrc启动子启动，并分别得到菌株dar-02、dar-03；然后敲除腺苷脱氨酶基因 add、嘌呤核苷磷酸化酶 deod、黄嘌呤碱磷酸化酶 xapa、核苷二磷酸激酶基因 ndk，阻断分解途径，分别得到菌株dar-04、dar-05、dar-06、dar-07；然后在基因组ycgh位点双拷贝5'-脱氧核苷酸酶基因 yfbr和腺苷酸激酶基因 adk，由pt7启动子启动得到菌株dar-08；最后导入pet-28a(+)-t4-nrdbca质粒，得到改造成功后的目的菌株dar-09。

6、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述出发菌株是野生型 e.coliw3110（atcc 273250）。

7、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述嘌呤操纵子基因 pur( ekbcsqlfmnhd)、腺苷酸琥珀酸合酶基因 pura和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因 purb均来自于腺苷工程菌株 b. subtilis168（atcc 23857），其中，所述嘌呤操纵子基因 pur( ekbcsqlfmnhd)的核苷酸序列如seq id no.1所示（ncbi-geneid分别为： pure：939481； purk：936039； purb：936048； purc：939389； purs：936041； purq：938760； purl：939233； purf：936046； purm：936044； purn：936045； purh：936053； purd：938741）；所述腺苷酸琥珀酸合酶基因 pura的核苷酸序列如seq id no.2所示（ pura；ncbi-geneid：935805）；所述腺苷酸琥珀酸裂解酶基因 purb的核苷酸序列如seq id no.3所示（ purb；ncbi-geneid：936048）。

8、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述腺苷脱氨酶基因 add的核苷酸序列如seq id no.4所示（ add；ncbi-geneid：945851）；所述嘌呤核苷磷酸化酶 deod的核苷酸序列如seq id no.5所示（ deod；ncbi-geneid：945654）；所述黄嘌呤碱磷酸化酶 xapa的核苷酸序列如seq id no.6所示（ xapa；ncbi-geneid：946878）；所述核苷二磷酸激酶 ndk的核苷酸序列如seq id no.7所示（ ndk；ncbi-geneid：945611）。

9、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述5'-脱氧核苷酸酶基因 yfbr的核苷酸序列如seq id no.8所示（ yfbr；ncbi-geneid：946771）；所述腺苷酸激酶基因 adk的核苷酸序列如seq id no.9所示（ adk；ncbi-geneid：945097）。

10、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述质粒pet-28a(+)-t4-nrdbca，以pet-28a(+)质粒为骨架，携带硫酸卡那霉素抗性基因和由pt7启动子表达的噬菌体埃希氏菌体t4 nrdbca基因，具有更适宜在大肠杆菌中高效表达的特性，所述pet-28a(+)质粒作为线性载体的核苷酸序列如seq id no.11所示。

11、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述硫酸卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如seq id no.14所示,所述噬菌体埃希氏菌体t4 nrdbca基因的核苷酸序列如seqid no.10所示。

12、上述核糖核苷酸还原酶nrdbca基因由噬菌体埃希氏菌体核糖核苷酸还原酶ia类β 亚基基因nrdb、nrdc硫氧还蛋白基因nrdc、类nrda需氧 ndp 还原酶大亚基基因nrda经密码子优化人工合成并连接在一起。

13、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述ptrc启动子具有序列表seq idno.12所示核苷酸序列，pt7启动子具有序列表seq id no.13所示核苷酸序列。

14、上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

15、（1）通过在 e. coliw3110的基因组 yjiv位点引入异源的嘌呤操纵子基因 pur( ekbcsqlfmnhd)（核苷酸序列如seq id no.1所示），由ptrc启动子启动，增强嘌呤代谢途径的碳代谢流；

16、（2）通过在基因组 yghx、ygay位点引入异源的腺苷酸琥珀酸合酶基因 pura（核苷酸序列如seq id no.2所示）和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因 purb（核苷酸序列如seq id no.3所示），分别由pt7启动子、ptrc启动子（pt7的核苷酸序列如seq id no.13、ptrc的核苷酸序列如seq id no.12所示）启动；

17、（3）敲除腺苷脱氨酶基因 add（核苷酸序列如seq id no.4所示） ，敲除嘌呤核苷磷酸化酶 deod（核苷酸序列如seq id no.5所示），敲除黄嘌呤碱磷酸化酶 xapa（核苷酸序列如seq id no.6所示），敲除核苷二磷酸激酶 ndk（核苷酸序列如seq id no.7所示），阻断2’-脱氧腺苷的分解途径；

18、（4）通过在基因组ycgh位点过表达5'-脱氧核苷酸酶基因 yfbr（核苷酸序列如seqid no.8所示）和腺苷酸激酶基因 adk（核苷酸序列如seq id no.9所示），由pt7强启动子启动（核苷酸序列如seq id no.13所示），强化2’-脱氧腺苷的生物合成途径；

19、（5）通过pet-28a(+)质粒线性载体（核苷酸序列如seq id no.11所示）过表达噬菌体埃希氏菌体 t4核糖核苷酸还原酶nrdbca（核苷酸序列如seq id no.10所示）。

20、上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌在生产2’-脱氧腺苷方面的应用。

21、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用，通过发酵罐培养的方法获得2’-脱氧腺苷。

22、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用，所述发酵罐培养的具体方法为：

23、（1）菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13 h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：35℃；

24、（2）种子培养：培养过程 ph 维持在 6.7±0.1，温度维持在35±0.2℃，溶氧维持在35%-50%，培养至od为20时转接发酵罐中进行发酵培养；

25、（3）发酵培养：按20%的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养过程中控制ph6.7±0.1，温度35±0.2℃，溶氧30%-50%；培养过程中通过流加 80%（m/v）葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25%的氨水来调节ph，使ph维持在6.7±0.1。

26、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用，采用的种子培养基为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉6g/l，蛋白胨4g/l，柠檬酸1g/l，(nh4)2so43g/l，mgso4·7h2o 0.4g/l，kh2po41.5g/l，feso4·7h2o 10mg/l，mnso45mg/l，vb1、vb3、vb5、vb12各2mg/l，vh 1mg/l，硫酸卡那霉素50mg/l，其余为水。

27、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用，采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉6g/l，蛋白胨2g/l，柠檬酸2g/l，(nh4)2so43g/l，mgso4·7h2o 1.5g/l，kh2po44g/l，feso4·7h2o 20mg/l，mnso410mg/l，vb1、vb3、vb5、vb12各2 mg/l，vh 1 mg/l，硫酸卡那霉素50mg/l，其余为水。

28、上述培养基均可采用标准方法制备获得。

29、有益效果：

30、上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，通过对 e.coli和 bacillus subtilis的嘌呤代谢相关途径进行分析，以野生型 e.coli.w3110为底盘微生物并在底盘微生物 e.coliw3110中异源引入嘌呤操纵子，通过基因组整合和质粒过表达2’-脱氧腺苷生物合成途径关键酶基因，敲除2’-脱氧腺苷分解途径等相关分子改造获得，具有遗传背景清晰、可持续改造等优点，该菌株发酵生产2’-脱氧腺苷操作简单、能以廉价碳源直接合成2’-脱氧腺苷，采用分批补料发酵法在发酵罐中48h发酵2’-脱氧腺苷产量可达到3.2g/l，具有很好的工业应用前景。