一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用

文档序号:36717265发布日期:2024-01-16 12:16阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌,其特征在于:是通过下述基因改造方法获得的:首先通过在出发菌株e.coliw3110的基因组yjiv位点引入异源的b.subtilis 168菌株嘌呤操纵子基因pur(ekbcsqlfmnhd),由ptrc启动子启动,得到菌株dar-01;然后在基因组yghx、ygay位点引入异源的b. subtilis 168菌株腺苷酸琥珀酸合酶基因pura和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因purb,分别由pt7启动子、ptrc启动子启动,并分别得到菌株dar-02、dar-03;然后敲除腺苷脱氨酶基因add、嘌呤核苷磷酸化酶deod、黄嘌呤碱磷酸化酶xapa、核苷二磷酸激酶基因ndk,阻断分解途径,分别得到菌株dar-04、dar-05、dar-06、dar-07;然后在基因组ycgh位点双拷贝5'-脱氧核苷酸酶基因yfbr和腺苷酸激酶基因adk,由pt7启动子启动得到菌株dar-08;最后导入pet-28a(+)-t4-nrdbca质粒,得到改造成功后的目的菌株。

2.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌,其特征在于:所述嘌呤操纵子基因pur(ekbcsqlfmnhd)的核苷酸序列如seq id no.1所示;所述腺苷酸琥珀酸合酶基因pura的核苷酸序列如seq id no.2所示;所述腺苷酸琥珀酸裂解酶基因purb的核苷酸序列如seq id no.3所示;所述腺苷脱氨酶基因add的核苷酸序列如seq id no.4所示;所述嘌呤核苷磷酸化酶deod的核苷酸序列如seq id no.5所示;所述黄嘌呤碱磷酸化酶xapa的核苷酸序列如seq id no.6所示;所述核苷二磷酸激酶ndk的核苷酸序列如seq id no.7所示;所述5'-脱氧核苷酸酶基因yfbr的核苷酸序列如seq id no.8所示;所述腺苷酸激酶基因adk的核苷酸序列如seq id no.9所示。

3.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌,其特征在于:所述质粒pet-28a(+)-t4-nrdbca,以pet-28a(+)质粒为骨架,携带硫酸卡那霉素抗性基因和由pt7启动子表达的噬菌体埃希氏菌体t4 nrdbca基因,所述pet-28a(+)质粒的核苷酸序列如seq idno.11所示。

4.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌,其特征在于:所述硫酸卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如seq id no.14所示,所述噬菌体埃希氏菌体t4 nrdbca基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。

5.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌,其特征在于:所述ptrc启动子具有序列表seq id no.12所示核苷酸序列,pt7启动子具有序列表seq id no.13所示核苷酸序列。

6.权利要求1-5之一所述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的构建方法,其特征在于:具体步骤如下:

7.权利要求1-5之一所述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌在生产2’-脱氧腺苷方面的应用。

8.根据权利要求7所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用,其特征在于:通过发酵罐培养的方法获得2’-脱氧腺苷。

9.根据权利要求8所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用,其特征在于:所述发酵罐培养的具体方法为:

10.根据权利要求9所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用,其特征在于:采用的种子培养基为:葡萄糖30g/l,酵母浸粉6g/l,蛋白胨4g/l,柠檬酸1g/l,(nh4)2so4 3g/l,mgso4·7h2o 0.4g/l,kh2po41.5g/l,feso4·7h2o 10mg/l,mnso45mg/l,vb1、vb 3、vb 5、vb 12各2mg/l,vh 1mg/l,硫酸卡那霉素50mg/l,其余为水;采用的发酵培养基为:葡萄糖30g/l,酵母浸粉6g/l,蛋白胨2g/l,柠檬酸2g/l,(nh4)2so4 3g/l,mgso4·7h2o 1.5g/l,kh2po44g/l,feso4·7h2o 20mg/l,mnso4 10mg/l,vb1、vb 3、vb 5、vb 12各2 mg/l,vh 1 mg/l,硫酸卡那霉素50mg/l,其余为水。


技术总结
本发明提供了一种生产2’‑脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用,所述基因工程菌是通过对E.coli和Bacillus subtilis的嘌呤代谢相关途径进行分析,以野生型E.coli.W3110为底盘微生物并在底盘微生物E.coliW3110中异源引入嘌呤操纵子,通过基因组整合和质粒过表达2’‑脱氧腺苷生物合成途径关键酶基因,敲除2’‑脱氧腺苷分解途径等相关分子改造获得的,具有遗传背景清晰、可持续改造等优点,该菌株发酵生产2’‑脱氧腺苷操作简单、能以廉价碳源直接合成2’‑脱氧腺苷,采用分批补料发酵法在发酵罐中48h发酵2’‑脱氧腺苷产量可达到3.2g/L,具有很好的工业应用前景。

技术研发人员:徐庆阳,时唐恩,赵思宇
受保护的技术使用者:天津科技大学
技术研发日:
技术公布日:2024/1/15
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