本发明属于分子生物学,涉及一种用于检测igk和igl基因的引物组合及其应用。
背景技术:
1、免疫球蛋白轻链淀粉样变性是一种惰性浆细胞疾病,其特征是游离轻链(flc)错误折叠和淀粉样纤维沉积在不同组织中,该疾病中存在免疫球蛋白轻链基因igk或igl的克隆性重排。在诊断为原发性淀粉样变性的患者中,大部分的血清或尿中发现m蛋白。免疫球蛋白轻链淀粉样变性临床表现多样且不具有特异性,使得疾病诊断困难且多数时间延误。理论上,除大脑外,任何器官均可受累,心脏是最常受累的器官,其次是肾脏、肝脏、胃肠道、软组织、外周和自主神经系统。其中,心脏对预后的影响最为显著。免疫球蛋白轻链淀粉样变性的器官趋向性可能是使用特异性轻链胚系基因的功能,如具有κ轻链的al患者有更多的肝脏受累,胚系基因iglv6-57和iglv1-44分别与肾脏和心脏受累增加有关。此外,免疫球蛋白轻链淀粉样变性中特异性胚系基因表达过多,也就是说,一些胚系基因,如iglv6-57、iglv3-01和iglv2-14,在免疫球蛋白轻链淀粉样变性中的发生频率高于其他浆细胞恶性肿瘤或正常b细胞。在免疫球蛋白合成过程中产生的轻链基因的体细胞突变增加了轻链结构的复杂性。体细胞突变的负担和发生突变的特定位点会影响轻链的稳定性和淀粉样蛋白生成能力。因此,检测免疫球蛋白轻链淀粉样变性患者中igk和igl基因,既可以分析m蛋白表达情况,也可以分析受累器官类型以及预后情况,还可能揭示不同患者受累器官的机理。
2、目前免疫球蛋白检测方法有蛋白电泳、免疫电泳或免疫固定法,但检测灵敏度低,阳性率约72%,免疫球蛋白轻链基因igk和igl基因检测比较普及的方法主要是依赖于一代测序平台毛细管电泳方法检测dna,但是由于技术以及核酸类型的局限性,临床应用方面还是存在着以下缺点:检测灵敏度低;检测结果不能够显示出具体igk和igl基因序列以及家族信息;免疫球蛋白轻链淀粉样变性患者异常克隆浆细胞比例低,dna检测阳性率低。
3、综上所述,开发高效、稳定的检测igk和igl基因的方法,对于免疫球蛋白轻链淀粉样变性研究领域具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种用于检测igk和igl基因的引物组合及其应用,基于高通量测序的手段检测igk和igl基因,显著提高检测灵敏度及准确性,并且可以准确地得到序列信息。
2、为达上述目的,本发明采用以下技术方案:
3、第一方面,本发明提供一种用于检测igk和igl基因的引物组合,所述引物组合包括igk引物和igl引物;所述igk引物包括11条前置引物和3条后置引物,所述前置引物的核酸序列包括seq id no.1~seq id no.11所示的序列,所述后置引物的核酸序列包括seq idno.12~seq id no.14所示的序列;所述igl引物包括8条前置引物和4条后置引物,所述前置引物的核酸序列包括seq id no.15~seq id no.22所示的序列,所述后置引物的核酸序列包括seq id no.23~seq id no.26所示的序列。
4、本发明中,开发基于高通量测序技术同时检测人免疫球蛋白轻链igk和igl基因的多重pcr引物组合,开发使用高通量测序技术来对骨髓等样本中(如轻链型淀粉样变性患者骨髓中)rna的igk和igl基因进行分析,可以全方位了解igk和igl基因克隆性重排以及表达情况,igk和igl v区基因使用以及突变,同时可预测igl蛋白结构。
5、本发明深入分析轻链型淀粉样变性疾病特征,异常克隆性浆细胞水平较低,但是异常克隆性浆细胞表达免疫球蛋白轻链水平较高,巧妙利用rna替代dna检测轻链基因,同时扩增igk和igl基因序列,了解轻链类型、表达情况、轻链v区类型以及突变情况。
6、seq id no.1:gtaaaacgacggccagtaagtggggtcccatcaaggttcag。
7、seq id no.2:gtaaaacgacggccagtagtcccatctcggttcagtggcag。
8、seq id no.3:gtaaaacgacggccagtgaaacaggggtcccatcaaggttc。
9、seq id no.4:gtaaaacgacggccagttcccagacagattcagtggcagtg。
10、seq id no.5:gtaaaacgacggccagtctggagtgccagataggttcagtg。
11、seq id no.6:gtaaaacgacggccagtccctggagtcccagacaggttcag。
12、seq id no.7:gtaaaacgacggccagtgcatcccagccaggttcagtg。
13、seq id no.8:gtaaaacgacggccagtgtccctgaccgattcagtggca。
14、seq id no.9:gtaaaacgacggccagtaatcccacctcgattcagtggc。
15、seq id no.10:gtaaaacgacggccagtctcaggggtcccctcgaggtt。
16、seq id no.11:gtaaaacgacggccagtagacactggggtcccagcca。
17、seq id no.12:taatacgactcactatagggacgtttgatctccaccttggtccc。
18、seq id no.13:taatacgactcactatagggacgtttgatatccactttggtccc。
19、seq id no.14:taatacgactcactatagggacgtttaatctccagtcgtgtccc。
20、seq id no.15:gtaaaacgacggccagtattctctggctccaagtctggc。
21、seq id no.16:gtaaaacgacggccagtggatccctgagcgattctctgg。
22、seq id no.17:gtaaaacgacggccagtgagttcctgatcgcttctcagg。
23、seq id no.18:gtaaaacgacggccagttccccagccgcttctctgg。
24、seq id no.19:gtaaaacgacggccagtacacctgcccggttctcagg。
25、seq id no.20:gtaaaacgacggccagtgcatccctgatcgcttctcagt。
26、seq id no.21:gtaaaacgacggccagtcagcctccctgaccattactgg。
27、seq id no.22:gtaaaacgacggccagtggtccccagtcgagtctctgg。
28、seq id no.23:taatacgactcactatagggctaggacggtgagcttggtccc。
29、seq id no.24:taatacgactcactatagggctaaaatgatcagctgggttcc。
30、seq id no.25:taatacgactcactatagggctaggacggtcagctcggtccc。
31、seq id no.26:taatacgactcactatagggcgaggacggtcagctgggtgcc。
32、本发明中,巧妙设计特性序列引物组合,能够保证以最少的引物扩增出所有家族的等位基因,同时降低多重pcr引物间相互作用,提高引物扩增效率。
33、优选地,所述引物组合还包括接头引物。
34、优选地,所述接头引物包括ion torrent平台接头引物。
35、优选地,所述接头引物包括12条前置引物和1条后置引物,所述前置引物的核酸序列包括seq id no.27~seq id no.38所示的序列,所述后置引物的核酸序列包括seq idno.39所示的序列。
36、seq id no.27:
37、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccgcatggaacgatgtaaaacgacggccag。
38、seq id no.28:
39、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagctggcaatcctcgatgtaaaacgacggccag。
40、seq id no.29:
41、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccggagaatcgcgatgtaaaacgacggccag。
42、seq id no.30:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtccacctcctcgatgtaaaacgacggccag。
43、seq id no.31:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagcagcattaattcgatgtaaaacgacggccag。
44、seq id no.32:
45、ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtctggcaacggcgatgtaaaacgacggccag。
46、seq id no.33:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtcctagaacacgatgtaaaacgacggccag。
47、seq id no.34:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtccttgatgttcgatgtaaaacgacggccag。
48、seq id no.35:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtctagctcttcgatgtaaaacgacggccag。
49、seq id no.36:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtcactcggatcgatgtaaaacgacggccag。
50、seq id no.37:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagttcctgcttcacgatgtaaaacgacggccag。
51、seq id no.38:ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccttagagttcgatgtaaaacgacggccag。
52、seq id no.39:ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgattaatacgactcactataggg。
53、第二方面,本发明提供第一方面所述的用于检测igk和igl基因的引物组合在制备检测igk和igl基因的产品中的应用。
54、第三方面,本发明提供一种检测igk和igl基因突变的试剂盒,所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测igk和igl基因的引物组合;所述试剂盒还包括反转录试剂、多重pcr扩增试剂或测序接头扩增试剂中任意一种或至少两种的组合。
55、优选地,所述多重pcr扩增试剂包括dna聚合酶和扩增缓冲液。
56、所述测序接头扩增试剂包括dna聚合酶和扩增缓冲液。
57、第四方面,本发明提供一种构建igk和igl基因文库的方法,所述方法包括:
58、取待测样本中rna,进行反转录,得到cdna,以所述cdna为模板,利用第一方面所述的用于检测igk和igl基因的引物组合进行多重pcr扩增,将多重pcr扩增产物与所述接头引物混合,进行接头pcr扩增反应,得到所述igk和igl基因文库。
59、优选地,所述待测样本为骨髓。
60、优选地,所述多重pcr扩增的条件为:(1)93~96℃预变性8~12 min;(2)93~95℃变性1~3 min、60~65℃退火1~3 min、70~73℃延伸25~35 s,30~40个循环;(3)70~73℃延伸8~12 min;
61、优选地,所述接头pcr扩增反应的条件为:(1)94~96℃预变性10~14 min;(2)93~95℃变性25~35 s、60~65℃退火25~35 s、70~73℃延伸25~35 s,18~23个循环;(3)70~73℃延伸3~6 min。
62、第五方面,本发明提供一种以非疾病诊断为目的的检测igk和igl基因的方法,所述方法包括:
63、利用第四方面所述的构建igk和igl基因文库的方法构建igk和igl基因文库,对所述igk和igl基因文库进行纯化,将纯化后igk和igl基因文库进行上机测序及数据分析,判断igk和igl基因情况。
64、优选地,所述纯化的方法包括磁珠纯化法。
65、本发明设计特定的引物组合,保证准确、稳定扩增得到igk和igl基因基因序列,得到基因文库,同时结合高通量测序技术,可以极大的提高检测灵敏度及准确性,具有广泛的应用前景,例如淀粉样变性患者异常克隆轻链基因序列鉴定、v区突变情况、轻链基因表达情况、轻链蛋白预测等。
66、第六方面,本发明提供一种检测igk和igl基因的装置,所述装置包括文库构建单元和测序单元。
67、所述文库构建单元用于执行包括:利用第四方面所述的构建igk和igl基因文库的方法构建igk和igl基因文库,对所述igk和igl基因文库进行纯化。
68、所述测序单元用于执行包括:将文库构建单元纯化后igk和igl基因文库进行上机测序及数据分析,判断igk和igl基因情况。
69、第七方面,本发明提供一种用于igk和igl基因的高通量测序检测的系统,所述系统包括第三方面所述的检测igk和igl基因突变的试剂盒和高通量测序平台。
70、与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
71、本发明巧妙设计多组引物组合,能够保证以最少的引物扩增出所有家族的等位基因,同时降低多重pcr引物间相互作用,提高引物扩增效率,保证准确、稳定扩增得到igk和igl基因序列,得到基因文库,便于进行高通量测序分析,显著提高检测灵敏度及准确性,并且可以准确地得到序列信息。