核苷亚磷酰胺单体及其制备方法和应用与流程

本发明属于化学合成领域，具体而言，涉及核苷亚磷酰胺单体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、用于寡核苷酸合成的核苷亚磷酰胺单体质量要求高，需要通过柱层析来获得最终产品，纯化难度大，不利于放大制备；且现有的固相合成方法中，合成超过60个碱基长度的寡核苷酸就会出现逐渐严重的脱嘌呤和缺碱基的情况，且合成的寡核苷酸粗品纯度低，后续纯化难度较大。本发明的目的是通过调整现有核苷亚磷酰胺单体的化学结构，解决现有用于寡核苷酸合成的核苷亚磷酰胺单体碱基保护基团种类多、难以结晶纯化的问题，进而可通过结晶及过滤的方式获得最终产品，降低核苷亚磷酰胺单体的生产成本，减少寡核苷酸固相合成中脱嘌呤和缺碱基的情况产生，最终达到提高固相合成寡核苷酸纯度的目的。

2、寡核苷酸由核苷亚磷酰胺单体通过经典的固相合成的方法制备，广泛应用于新型治疗策略开发、基因编辑、核酸药物等领域。而合成寡核苷酸的原辅料成本中，核苷亚磷酰胺单体占主要部分。现有核苷亚磷酰胺单体的碱基保护基包括苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基等基团，通过苯甲酰氯、苯甲酸酐、异丁酰氯、乙酸酐等试剂与碱基上的氨基发生反应完成碱基保护。

3、以下是典型的核苷亚磷酰胺单体合成过程（以dmt-dc(bz)亚磷酰胺单体的合成为例）：

4、，

5、其中，dmt表示4,4'-二甲氧基三苯甲基。

6、产物核苷亚磷酰胺单体均需要通过柱层析获得高纯度的产品，成本高，工艺复杂。现有核苷亚磷酰胺单体的碱基保护基包括苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基等基团，中间体在与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦反应后，产品无法通过结晶的方式获得，只能通过柱层析纯化，增加了产品生产成本，且工业化放大难度高。不同的碱基需要对应不同的保护基，合成过程繁琐，成本高。在固相合成寡核苷酸第一步脱除dmt保护基团时，在酸（二氯乙酸或三氯乙酸）的作用下，因保护碱基自身的不稳定性，容易在该步骤发生脱碱基，影响寡核苷酸粗产品的纯度。

7、核苷亚磷酰胺单体的合成工艺复杂、质量控制指标多、成本高，其质量直接影响了后续通过固相合成得到的寡核苷酸的质量。因此，迫切需要开发一种新型核苷亚磷酰胺单体用于寡核苷酸的合成。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，针对现有的核苷亚磷酰胺单体难以通过结晶纯化、保护基种类多，及其在寡核苷酸合成过程中易产生脱碱基等问题，本发明提供一种简便易得、成本低廉的核苷亚磷酰胺单体化学结构及其合成方法与纯化方法，同时提高在固相合成寡核苷酸过程中脱保护步骤酸性环境下保护碱基的稳定性，最终达到提高寡核苷酸粗产品纯度的目的。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

2、在一种实施方式中，本发明提供一种核苷亚磷酰胺单体，所述单体通式结构如下，

3、，其中，r1是氢、烷氧基、卤素或烷氧基硅烷基团，base是碱基a（腺嘌呤）、碱基g（鸟嘌呤）或碱基c（胞嘧啶），r2表示a、g、c三种不同碱基上的保护基团，r2是或。

4、在一种实施方式中，本发明提供制备上述核苷亚磷酰胺单体方法，包括以下步骤：

5、，

6、第一步：式a化合物与式b化合物先经酸胺缩合，再利用成五元环的驱动力，经分子内胺酯交换，得到酰亚胺保护的中间体01；

7、第二步：将步骤1得到的产物溶解，加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷，保温反应，反应结束后加入甲醇淬灭反应，纯化后得到中间体02；

8、第三步：将中间体02溶解，加入四氮唑作为催化剂，加入双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，室温反应，反应结束后经过冰水萃取，收集下层有机相，干燥过滤后减压蒸干得粗品；用二氯甲烷、乙酸乙酯或二者的混合物溶解粗品，缓慢滴加至正庚烷或正己烷中，滴加的过程中因溶液溶解性变化析出固体，在惰性氛围下过滤和烘干得到所述核苷亚磷酰胺单体。

9、在一种实施方式中，所述步骤2中反应体系水分含量不大于490 ppm。

10、在一种实施方式中，所述步骤2中加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷的物质的量为中间体01物质的量的1.05~1.15倍。

11、在一种实施方式中，所述步骤2中加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷的物质的量为中间体01物质的量的1.05~1.10倍。

12、在一种实施方式中，所述步骤2中保温反应的反应温度区间为0±5 ℃。

13、在一种实施方式中，本发明提供上述核苷亚磷酰胺单体在合成核酸中的应用。

14、在一种实施方式中，在合成核酸中脱除所述核苷亚磷酰胺单体上r2保护基团时，使用水合肼溶液。

15、在一种实施方式中，使用水合肼乙醇溶液、水合肼水溶液或水合肼乙腈溶液。

16、在一种实施方式中，使用20%-50%体积浓度的水合肼乙醇溶液。

17、本发明所述核苷亚磷酰胺单体的化学结构如下：，其中：

18、r1是氢、烷氧基、卤素或烷氧基硅烷基团；

19、base是碱基a（腺嘌呤）、碱基g（鸟嘌呤）或碱基c（胞嘧啶）；

20、r2表示a、g、c三种不同碱基上的保护基团，组合结构如下所示：

21、。

22、在使用本发明的r2保护基团后，比目前常用的苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基等保护基，增加了分子结构中的刚性结构，使分子的易结晶性提高，使所得的核苷亚磷酰胺单体粗品可通过简易析晶的方案进行分离纯化的策略得以实现。相比于邻苯二甲酰亚胺类的保护基，2,3-萘二甲酰亚胺类保护基的分子刚性又有所增大。即通过优化核苷碱基的保护基结构，来改善核苷亚磷酰胺单体分子的物理性质，实现了用简单的析晶操作进行分离纯化并得到高品质的产物。

23、产物核苷亚磷酰胺单体用二氯甲烷、乙酸乙酯或二者的混合物溶解粗品，缓慢滴加至正庚烷或正己烷中，滴加的过程中因溶液溶解性变化析出固体，不需要通过柱层析获得高纯度的产品，因此合成单体的成本降低，工艺简单，工业化放大难度显著减小。

24、在本发明中，三种不同的碱基a、g和c，都可以使用本发明r2相同的保护基，合成过程简化，成本降低。

25、在固相合成寡核苷酸第一步脱除dmt保护基团时，本发明的核苷亚磷酰胺单体在酸性（二氯乙酸或三氯乙酸）环境下保护碱基的稳定性提高，减少了在该步骤发生脱碱基，提高了寡核苷酸粗产品的纯度。使用本发明的核苷亚磷酰胺单体合成寡核苷酸，都能够达到减少脱嘌呤和缺碱基的杂质以及提高粗产品纯度的目的。本发明核苷亚磷酰胺单体合成的dna核酸中，脱嘌呤和缺碱基的杂质更少。

技术特征：

1.一种核苷亚磷酰胺单体，其特征在于，所述单体通式结构如下，

2.制备权利要求1所述的核苷亚磷酰胺单体方法，其特征在于，所述方法如下所示，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中反应体系水分含量不大于490ppm。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2中加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷的物质的量为中间体01物质的量的1.05~1.15倍。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2中加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷的物质的量为中间体01物质的量的1.05~1.10倍。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2中保温反应的反应温度区间为0±5 ℃。

7.权利要求1所述的核苷亚磷酰胺单体在合成核酸中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在合成核酸中脱除所述核苷亚磷酰胺单体上r2保护基团时，使用水合肼溶液。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用水合肼乙醇溶液、水合肼水溶液或水合肼乙腈溶液。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，使用20%-50%体积浓度的水合肼乙醇溶液。

技术总结
本发明提供一种核苷亚磷酰胺单体及其制备方法和应用，在使用本发明的R2保护基团后，比目前常用的苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基等保护基，增加了分子结构中的刚性结构，使分子的易结晶性提高，使所得的核苷亚磷酰胺单体粗品可通过简易析晶的方案进行分离纯化的策略得以实现。本发明核苷亚磷酰胺单体合成的DNA核酸中，脱嘌呤和缺碱基的杂质更少。

技术研发人员：方鑫,赵振华,乔建超,苏敏
受保护的技术使用者：北京百力格生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15