PRE1基因在调控油菜抗倒伏中的应用

本发明涉及作物学与农业分子生物领域，尤其涉及pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用。

背景技术：

1、甘蓝型油菜(brassica napus l.)是全球食用植物的重要来源之一。菜籽油在全球植物油中的占比为13-16％，约占自产食用植物油的50％。

2、实现单位面积产量提高，是解决我国需油量大，自产自足的有效途径。我国油菜种植密度在6000-8000株/亩，加拿大达到30000株/亩。我国主要种植油菜地区油菜平均产量在2950.4-3 112.9kg/hm2；而加拿大油菜品种平均产量分别为3 496.5-4 689.8kg/hm2。由此来看，采用高密度种植是提高油菜产量的有效方法。

3、但是实践证明过密种植将会导致油菜减产，这是因为高密度种植导致作物被邻近植物或者是作物冠层所遮挡，形成荫蔽环境。荫蔽环境会引起作物茎干徒长；研究发现，茎干徒长是导致倒伏的主要因素(马宁,张冰冰,徐宇等.不同株高甘蓝型油菜茎秆特性及其与倒伏的相关性[j].西北农业学报,2021,30(02):203-211)。

4、油菜作为全球重要的油料作物也面临着高密度种植引起的倒伏问题，倒伏会引起产量和菜籽油的品质降低。因此，改善甘蓝型油菜的耐荫蔽响应，优化作物高密度种植，为实现油菜增产提供理论基础是我们迫切需要解决的问题。

技术实现思路

1、本发明提供了pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，可用于作物品质改良，为加深研究及荫蔽环境下油菜抗倒伏等性状的研究提供了新的基因资源及理论指导。

2、具体技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，所述pre1基因包括pre1.a07基因与pre1.c06基因，所述pre1.a07的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述pre1.c06的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、进一步地，所述应用的途径为通过破坏pre1基因的功能，来提高油菜抗倒伏的能力。

5、进一步地，所述破坏的途径为通过沉默pre1基因、敲除油菜的pre1基因或抑制pre1基因的表达以提高油菜抗倒伏的能力。

6、进一步地，所述敲除的手段为crispr/cas9基因编辑技术。

7、本发明通过rna-seq分析找到了一个能够影响荫蔽环境油菜抗倒伏的基因，命名为pre1(paclobutrazol resistance1)。并且采用crispr-cas9技术，在甘蓝型油菜野生型westar中敲除pre1基因，获得双拷贝基因功能缺失的bnpre1.a07、bnpre1.c06双等位突变体(下称bnpre1突变体)。bnpre1突变体在白光下生长一段时间后，转移到模拟庇荫条件下继续生长，相比野生型，bnpre1突变体未出现倒伏现象，表明，pre1基因是一个植物在庇荫环境下抗倒伏相关基因，其会影响植物生长发育。

8、利用上述基因可以促进荫蔽环境油菜抗倒伏，是因为pre1基因表达量降低将影响植物下胚轴的伸长，从而增强了植物在荫蔽环境下抗倒伏的能力。

9、甘蓝型油菜pre1基因缺失引起下胚轴在荫蔽环境下下胚轴伸长缓慢的表型，为期在后续的生长中提供可抗倒伏能力的提升。本发明研究表明，将pre1基因敲除可以将野生型westar变为抗倒伏突变体。

10、第二方面，本发明提供了pre1基因的编码蛋白在调控油菜抗倒伏中的应用，所述pre1.a07基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示，所述pre1.c06基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示。

11、第三方面，本发明提供了一种工程菌，所述基因工程菌中包含有编辑pre1基因的crispr/cas9载体，所述pre1基因包括pre1.a07基因与pre1.c06基因，所述pre1.a07的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述pre1.c06的核苷酸序列如seq id no.2所示。

12、第四方面，本发明提供了一种所述工程菌在调控油菜抗倒伏中的应用。

13、进一步地，所述应用包括以下步骤：

14、(1)设计pre1基因的靶序列，构建crispr/cas9载体；

15、(2)构建含步骤(1)所述crispr/cas9载体的农杆菌基因工程菌；

16、(3)将步骤(2)中所述基因工程菌转化甘蓝型油菜，获得不含外源cas9蛋白且稳定遗传的纯合单突变体株系。

17、进一步地，所述靶序列包括sgrna-a07与sgrna-c06，所述sgrna-a07的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述sgrna-c06的核苷酸序列如seq id no.8所示。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、(1)本发明通过破坏pre1基因的功能以实现甘蓝型油菜在荫蔽环境下抗倒伏能力的增强。

20、(2)本发明首次公开了pre1基因表达缺失会导致甘蓝型油菜的下胚轴生长缓慢。

21、(3)本发明为油菜抗倒伏研究和应用提供了新的基因资源及理论指导。

技术特征：

1.pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，其特征在于：所述pre1基因包括pre1.a07基因与pre1.c06基因，所述pre1.a07的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述pre1.c06的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，其特征在于：所述应用的途径为通过破坏pre1基因的功能，来提高油菜抗倒伏的能力。

3.根据权利要求2所述的pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，其特征在于：所述破坏的途径为通过沉默pre1基因、敲除油菜的pre1基因或抑制pre1基因的表达以提高油菜抗倒伏的能力。

4.根据权利要求3所述的pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，其特征在于，所述敲除的手段为crispr/cas9基因编辑技术。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的pre1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，其特征在于：所述油菜为甘蓝型油菜。

6.pre1基因的编码蛋白在调控油菜抗倒伏中的应用，其特征在于：所述pre1基因的编码蛋白包括pre1.a07编码蛋白与pre1.c06编码蛋白；所述pre1.a07编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示，所述pre1.c06编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示。

7.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌中包含有编辑pre1基因的crispr/cas9载体，所述pre1基因包括pre1.a07基因与pre1.c06基因，所述pre1.a07的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述pre1.c06的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8.如权利要求7所述的基因工程菌在调控油菜抗倒伏中的应用，其特征在于：实现途径包括以下步骤：

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述靶序列包括sgrna-a07与sgrna-c06，所述sgrna-a07的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述sgrna-c06的核苷酸序列如seq idno.8所示。

技术总结
本发明涉及作物学与农业分子生物领域，尤其涉及PRE1基因在调控油菜抗倒伏中的应用，所述PRE1基因包括PRE1.A07基因与PRE1.C06基因，所述PRE1.A07的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PRE1.C06的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，应用的方法为通过破坏PRE1基因的功能，来提高油菜抗倒伏的能力。本发明还提供了用于破坏PRE1基因功能的工程菌以及方法，为油菜抗倒伏研究和应用提供了新的基因资源及理论指导。本发明构建的基因敲除突变体，其下胚轴在庇荫环境下生长缓慢，从而得到倒伏比例下降的特异性植物。

技术研发人员：董杰,李亚菲,孙宁,徐艳景,畅超艳
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21