一种美拉诺坦-II的液相合成方法

本发明涉及多肽药物制备领域，具体涉及一种美拉诺坦-ii的液相合成方法。

背景技术：

1、性功能障碍(erectile dysfunction,ed)是男性的常见病、多发病。由美国亚利桑那大学医学院研究开发一种促黑素细胞激素的环肽类似物美拉诺坦-ii，可在不受任何刺激的情况下调节中枢神经系统，诱发勃起，治疗ed效果明显。美拉诺坦-ii是一种合成的环七肽，它含有acth和msh共同的黑皮质素受体结合区，是一种非特异性mcr激动剂，在器质性和心因性勃起功能障碍的男性中起作用，不仅仅适合男性，对女性亦有促进性欲的作用。美拉诺坦-ii常以恶心和打哈欠作为常见的副反应，其中严重恶心的发生率为15.3％。使用美拉诺坦-ii增加性欲的观察是新颖的，值得进一步研究，研究定位作用部位和受体亚型介导黑素瘤ii的作用可能会是靶向治疗ed。

2、美拉诺坦-ii的化学结构式如下所示：

3、

4、2006年，专利cn101195654b报道了使用固相多肽合成法制备美拉诺坦-ii的方法，该合成路线包含以下步骤：作者将asp和lys两个氨基酸所使用的侧链保护基为-ome和-tfa。首先，使用fmoc-linker amide am resin作为载体树脂，然后按照fmoc固相多肽合成法将氨基酸序列由c端向n端依次偶联，得到全保护线性美拉诺坦-ii。接下来，使用naoh的二氧六环溶液脱除氨基酸上的-ome和-tfa侧链保护基，在缩合剂存在的条件下直接在树脂上成环。最后，在三氟乙酸的条件下将多肽序列从树脂上裂解下来，并脱除所有氨基酸的侧链保护基，得到美拉诺坦-ii粗品，经制备hplc纯化，冷冻干燥得到美拉诺坦-ii终产品。该方法的优势在于保护基便宜，易得，但使用树脂比较昂贵，且氨基酸与树脂载体的投料比高，增加了生产成本。2021年，在cn113621022a专利中，作者介绍了一种环肽的合成方法，在对美拉诺坦-ii制备过程中，作者采用固相多肽合成法，其中asp和lys的侧链保护基分别采用-oall和-alloc进行保护，脱除方法为采用四三苯基膦钯催化剂，大大增加了生产成本，不利于工业上大规模生产。

技术实现思路

1、基于以上现有存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种美拉诺坦-ii的液相合成方法，该方法结合了经典液相多肽合成和固相多肽合成两个方法的优点，在偶联与脱保护反应过程中属于均相反应，可以通过tlc监测反应的进程，在后处理过程中仅需加入不良溶剂即可析出产物，大大缩短了合成工艺的周期。

2、为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供一种美拉诺坦-ii的液相合成方法，包含以下步骤：

4、s1：在疏水性标签tag载体上偶联fmoc-lys(boc)-cooh制备c末端连有疏水性标签保护的赖氨酸，其结构为fmoc-lys(boc)-tag，然后脱除n端fmoc保护基，得到nh2-lys(boc)-tag；

5、s2：使用经典液相多肽合成法制备保护的中间体四肽片段，其氨基酸序列为：r1-his(r2)-d-phe-arg(r3)-trp-r4，r1、r2、r3和r4均为保护基。

6、s3：在步骤s1所得nh2-lys(boc)-tag基础上，使用fmoc化学合成法依次与保护的中间体四肽片段、fmoc-asp(otbu)-cooh和ac-nle-cooh进行偶联得到c末端连有疏水性标签载体的全保护线性美拉诺坦-ii；

7、s4：将步骤s3所得全保护线性美拉诺坦-ii在tfa裂解液条件下脱除c末端疏水性标签和氨基酸侧链保护基得到脱保护线性美拉诺坦-ii，进一步在缩合剂存在下发生偶联环化反应得到美拉诺坦-ii粗品，经色谱纯化得到美拉诺坦-ii纯品。

8、进一步地，步骤s1中，所述疏水性标签tag载体为双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺，主要通过以4,4'-二(二十二烷氧基)二苯甲酮和1-溴二十二烷为原料依次经过烷基化、还原、取代和脱保护反应制备而成。

9、进一步地，步骤s1中，所述nh2-lys(boc)-tag的制备方法为：

10、(1)将疏水性标签tag载体溶解于反应溶剂中，依次加入fmoc-lys(boc)-cooh、添加剂、缩合剂和碱，在0℃条件下反应0.5～1h，移至室温继续反应，tlc监测反应终点，反应结束后，减压浓缩反应液，向残余物中加入不良溶剂析出产物，得到fmoc-lys(boc)-tag；

11、(2)将上述制备的fmoc-lys(boc)-tag溶解于反应溶剂中，加入脱fmoc保护液，tlc监测反应终点，反应结束后，减压浓缩反应液，向残余物中加入不良溶剂析出产物，得到nh2-lys(boc)-tag。

12、进一步地，所述的添加剂为hobt、6-no2-hobt、6-cf3-hobt、hoat、6-cl-hobt、6-hoat、4-hoat、hodhat、hodhad、hosu、honb、hoct、hopy、hobi、hoi、6-cl-hobi、oxyma中的一种或几种。添加剂优选为hobt、hoat、hosu、honb中的一种。

13、进一步地，所述的缩合剂为下列中的至少一种：碳二亚胺类dcc、dic、edci、cic、bmc、bec、cpc中的一种或几种；四甲基铵盐类hbtu、tbtu、tdtu、hdtu、tdatu、hdatu、tptu、hptu、tstu、hstu、tpftu、hpftu、cf3-hbtu、hatu、tatu、hattu、hott、totu、hotu中的一种或几种；磷盐类bop、brop、pyclop、pybrop、clop、pybop、aop、pyaop、pyoxm、pynop、pyfop、pyfnbop、pyclok中的一种或几种。缩合剂优选为dic、edci、cic、tbtu、hbtu、pybop中的一种或几种。

14、进一步地，所述碱为nmm、dipea、et3n、na2co3中的一种或几种。碱优选为nmm、dipea中的一种。

15、进一步地，所述步骤(1)中疏水性标签tag、fmoc保护的氨基酸或片段、缩合剂、添加剂与碱摩尔比为1：1.1～3：1.1～3：1.1～3：2～8。

16、更进一步地，优选疏水性标签tag、fmoc保护的氨基酸或片段、缩合剂、添加剂与碱摩尔比为1：1.1～1.5：1.2～1.5：1.2～1.5：2.4～3。

17、进一步地，所述步骤(1)或(2)中反应溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、三氯甲烷中的一种或几种，优选反应溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷；不良溶剂为甲醇、乙腈、水中的一种或几种，优选不良溶剂为甲醇或乙腈。

18、进一步地，所述步骤(2)中脱fmoc保护液为哌啶、二乙胺和dbu中的一种或几种。

19、进一步地，步骤s2中，所述氨基酸或肽片段序列的n端、c端和侧链基团均使用保护基进行保护，具体情况如下：

20、(1)n端r1所采用的保护基为ac、boc、cbz、fmoc、trt中的一种；

21、(2)his的侧链保护基r2所采用的保护基为boc、bzl、dnp、mtt、mmt、trt、tos中的一种；

22、(3)arg的侧链保护基r3所采用的保护基为alloc、boc、bzl、mtr、no2、pbf、tos中的一种；

23、(4)c端r4所采用的保护基为-ome、-otbu、-obn或h(h表示不适用保护基)中的一种。

24、进一步地，步骤s2中，所述制备保护的中间体四肽片段方法为：采用经典液相逐一缩合法制成，使用保护的氨基酸原料分别为his、d-phe、arg和trp，由c端向n端依次偶联，得到全保护的中间体四肽片段，接着分别脱除主链两端保护基，并在n端接上一个fmoc保护基，得到目标保护的中间体四肽片段；或者采用经典液相片段缩合法制成，使用保护的氨基酸原料分别为his、d-phe、arg和trp，先由his与d-phe偶联得到二肽片段his-d-phe，由arg和trp偶联得到二肽片段arg-trp；然后使用“2+2”的片段缩合法将两个二肽片段偶联合成全保护的中间体四肽片段，接着分别脱除主链两端保护基，并在n端接上一个fmoc保护基，得到目标保护的中间体四肽片段。

25、进一步地，步骤s3中，所述全保护线性美拉诺坦-ii的制备方法为：在nh2-lys(boc)-tag基础上，重复发生偶联与脱保护反应，其操作流程参照合成nh2-lys(boc)-tag中的步骤(1)和步骤(2)，将nh2-lys(boc)-tag溶解于反应溶剂中，依次与保护的中间体四肽片段、fmoc-asp(otbu)-cooh和ac-nle-cooh进行偶联。所述保护的中间体四肽片段记为fmoc保护的片段，fmoc-asp(otbu)-cooh和ac-nle-cooh都记为fmoc保护的氨基酸。nh2-lys(boc)-tag、fmoc保护的氨基酸或片段、缩合剂、添加剂与碱摩尔比为1：1.1～3：1.1～3：1.1～3：2～8。

26、进一步地，步骤s4中，所述脱除c末端疏水性标签和氨基酸侧链保护基的方法为：向反应体系中加入tfa裂解液体系，在室温下反应2～5h，反应结束后浓缩反应液，向体系加入不良溶剂析晶，抽滤，洗涤得到脱保护线性美拉诺坦-ii粗品。

27、进一步地，所述的裂解液种类为三氟乙酸、茴香硫醚、三异丙基硅烷和水的混合溶液，其中体积比为87～95：2～5：2～5：2～5，优选体积比为90～95：2～3：2～3：2～3。所述的不良溶剂为乙醚、甲基叔丁基醚、异丙醚中的一种或几种，更优选为甲基叔丁基醚。

28、进一步地，步骤s4中，所述缩合剂为碳二亚胺类、磷盐类、四甲基铵盐类中的一种或几种。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果是：我们开发了一种美拉诺坦-ii的新型液相合成方法，基于疏水性标签载体为辅助，以保护的his-d-phe-arg-trp为中间体，液相法合成美拉诺坦-ii，采用经典液相合成法合成中间体四肽片段，优势在于革除n端fmoc保护的氨基酸，使用n端boc保护的氨基酸，提高了该片段反应的原子经济性，同时可以通过重结晶操作对中间体四肽片段进行提纯，进一步提高全保护线性美拉诺坦-ii的纯度。同时采用片段缩合法的形式进行偶联，避免多次脱除fmoc保护基，使其反应效率更高。使用双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺作为疏水性标签为辅助，使其氨基酸和缩合剂的投料比降低、反应均相且可通过tlc进行监测，后处理仅需加入甲醇或乙腈即可析出产物并洗涤，简单高效。