一种TaqDNA聚合酶突变体及其制备方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、taq dna聚合酶是1988年，saiki等首次从生长在70-75℃火山温泉中生长的水生栖热菌(thermus aquaticus)中分离得到，并成功应用到pcr技术中。不但实现了pcr自动化，也因为提高退火温度和延伸温度而提高了产物特异性。野生型taq dna聚合酶全长832aa，相对分子量94kda，理论总平均亲水指数为-0.282。该酶具有良好的耐热性，最适催化温度为75-80℃，95℃半个小时仍能保留50％左右的活性。具有5’-3’聚合酶活性，同时还具有一定的5’-3’外切核酸酶活性，此外，还可在pcr产物3’末端加a。

2、近年来，dna聚合酶在分子诊断领域发挥着重要作用，但是，当前商业化的耐热dna聚合酶在热稳定性、合成能力、速度、保真度和特异性等方面的性能不尽相同。目前我国分子诊断，测序等需求日益增大，需要生产成本更低，活性更高，热稳定性更强，合成能力、合成速度和特异性等性能更强的taq dna聚合酶来满足市场需求。

3、目前，缺乏一种热稳定性高的taq dna聚合酶突变体及其制备方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种热稳定性高的taq dna聚合酶突变体及其制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明的一种taq dna聚合酶突变体，taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，对水生栖热菌(thermusaquaticus)野生型dna聚合酶的关键结构域进行缺失和点突变，缺失位置如下：260-264位氨基酸(lys-arg-arg-glu-pro)，点突变位置为glu713gly。

3、本发明编码taq dna聚合酶突变体的基因。以提高taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体在原核表达时的表达量，本发明还公开了一种针对大肠杆菌密码子优化后的taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体优化基因序列。

4、进一步地，taq dna聚合酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。该基因序列根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化设计。其表达蛋白多以可溶性蛋白形式存在，可以提高纯化蛋白的得率，其表达效果如图3所示，其中上清组份中可溶性taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体蛋白表达量远高于沉淀组份，taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体在95℃放置30分钟，仍具有80％活性。

5、本发明的一种包含新型taq dna聚合酶突变体编码序列的重组表达载体。

6、本发明的一种包含重组表达载体的重组菌株。

7、本发明的一种重组表达载体的重组细胞。

8、进一步地，重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。并被重组表达载体所转化。

9、本发明的一种制备新型taq dna聚合酶突变体的方法，包括如下步骤：

10、(1)合成编码taq dna聚合酶突变体基因序列；

11、(2)构建高效重组表达载体，得到重组质粒pet-taqe713g；

12、(3)用所述重组表达载体转化宿主菌bl21(de3)构建重组表达菌；

13、(4)利用所获得的重组表达菌的培养表达taq dna聚合酶突变体；

14、(5)将步骤(4)所获得的表达产物的分离纯化，制得taq dna聚合酶突变体。

15、进一步地，在步骤(2)中，采用标准pcr技术扩增taq dna聚合酶新型突变体(δ260-264+e713g)基因，并在两端入加限制性酶切位点(ecor i,sal i)，限制酶酶切后，装在pet32a(+)载体相应酶切位点间，转化克隆宿主，筛选测序，制备质粒pet-taqe713g。

16、进一步地，在步骤(2)中，编码基因的特异性引物对为taqmut-ecor i-f/r；引物taqmut-ecor i-f具有seq id no.4的核苷酸序列；引物taqmut-ecor i-r具有seq id no.5的核苷酸序列。

17、采用标准pcr技术在片断的首尾引入合适的限制性酶切位点，装配入质粒pet-11a(novagen公司产品)转化宿主细胞，完成工程菌的构建。

18、将构建好的工程菌发酵，离心得到菌体，洗涤后破菌，离心收集上清，随后采用镍粒子亲和层析纯化蛋白，纯化的蛋白加入稳定剂后低温储存。

19、有益效果：本发明提高了重组taq dna聚合酶的可溶性和热稳定性，生产成本更低，活性更高的taq dna聚合酶来满足市场需求。

20、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

21、(1)提高了其在原核表达时的表达量，表达蛋白多以可溶性蛋白形式存在，可以提高纯化蛋白的得率，其中上清组份中可溶性taq dna聚合酶蛋白表达量远高于沉淀组份，重组taq dna聚合酶在95℃处理30分钟，其活性保留80％以上。

22、(2)本发明提高了taq dna聚合酶的扩增效率。相同反应条件下可以得到更多的pcr产物，本发明比较了野生型taq dna聚合酶与本发明的重组taq dna聚合酶扩增效果，重组dna聚合酶产生了更多的pcr产物。

技术特征：

1.一种taq dna聚合酶突变体，其特征在于：所述taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.编码权利要求1所述的taq dna聚合酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述的taq dna聚合酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

4.包含权利要求2所述的taq dna聚合酶突变体编码序列的重组表达载体。

5.包含权利要求4所述的重组表达载体的重组菌株。

6.权利要求4所述的重组表达载体的重组细胞。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。

8.一种制备权利要求1所述的taq dna聚合酶突变体的方法，其特征在于包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的taq dna聚合酶突变体的方法，其特征在于：在步骤(2)中，采用标准pcr技术扩增taq dna聚合酶新型突变体(δ260-264+e713g)基因，并在两端入加限制性酶切位点(ecori,sal i)，限制酶酶切后，装在pet32a(+)载体相应酶切位点间，转化克隆宿主，筛选测序，制备质粒pet-taqe713g。

10.根据权利要求8所述的taq dna聚合酶突变体的方法，其特征在于：在步骤(2)中，编码基因的特异性引物对为taqmut-ecor i-f/r；引物taqmut-ecor i-f具有seq id no.4的核苷酸序列；引物taqmut-ecor i-r具有seq id no.5的核苷酸序列。

技术总结
本发明公开了一种Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法。本发明的一种Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明编码所述的Taq DNA聚合酶突变体基因。所述的Taq DNA聚合酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提高了重组Taq DNA聚合酶的可溶性和热稳定性，生产成本更低，活性更高，合成能力、合成速度和特异性等性能更强的Taq DNA聚合酶来满足市场需求。

技术研发人员：杨洋,汪寄宇
受保护的技术使用者：上海馨瑷生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17