一种dCE-KODDNA聚合酶及其制备方法和应用

本发明属于分子生物学和蛋白质工程领域，具体涉及一种dce-kod dna聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,pcr)是近几十年来普及最迅速，应用最广泛的分子生物学技术。pcr是一种体外模拟体内的dna复制过程，从而大量扩增特定dna片段的基因操作技术。在模板dna、引物、dntp存在的条件下，dna聚合酶利用反应温度的循环变化，能够在2-3小时之内实现目的序列的指数级扩增。pcr技术广泛应用于分子克隆、基因组测序、法医学鉴定以及遗传病、传染病的诊断等方面，推动了精准医疗领域的发展，加速了基因与遗传病相关性的研究。但pcr技术也面临很多方面的局限性，例如血液和组织样本不能直接用于pcr，需要进一步提取dna作为扩增模板，同时pcr扩增的长度和扩增速度方面也有待进一步提高，这些需求驱使人们不断发现和改造dna聚合酶。

2、1988年，rand k saiki首次将从栖热水生菌(thermus aquaticus yt-1)来源的耐高温taq dna聚合酶应用于pcr，改变了以往在pcr循环过程中不断补加聚合酶的繁琐步骤，大大简化了pcr流程。但由于taq dna聚合酶缺乏3’-5’的核酸外切酶活性，在dna的体外合成的过程中无法及时校正错配的单核苷酸，导致pcr产物的忠实性较低。研究人员又陆续发现了tgo、vent、deep、pfu以及kod1等一系列具有校正功能的耐热dna聚合酶，显著提高了pcr扩增的保真性。但是，总的来说目前pcr常用的dna聚合酶在其天然宿主中的作用主要是进行dna损伤修复以及协助完成基因的重组等，因而它们的进行性和延伸速率都较低。随着医学检测和生命科学技术的不断进步，急需在保证pcr扩增灵敏性、特异性及忠实性的前提下，提高耐热dna聚合酶的延伸活性和延伸速度的策略。kod1 dna聚合酶来源于嗜热菌thermococcus kodakarensiskod1，因其良好的耐热性、高保真性和较高的进行性成为较关注的改造对象，发明人期望通过基因工程改造的手段进一步改善其酶学性质。

3、大肠杆菌产生的大肠杆菌素(colicin)是一种由质粒编码的蛋白质毒素，其中大肠杆菌素e家族的dna酶包括ce2、ce7、ce8和ce9，是一类结构高度保守的非专一性核酸内切酶。有报道表明，4种ce的dna酶结构域位于蛋白质分子的c端，约15kda，可以进行截短表达。与此同时，将ce的c端dna酶结构域中参与dna切割的氨基酸进行突变后获得的dce蛋白仍保留强的非特异性dna结合活性，但不会对dna进行切割。同时，发明人团队的前期工作发现dce具有很好热稳定性。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明尝试将dce蛋白与kod dna聚合酶融合表达后，首次发现dce能够显著提高kod dna聚合酶的特异性扩增效率，为耐高温dna聚合酶持续合成能力不高的问题提供了一种解决途径。

2、本发明的技术方案具体如下：

3、本发明第一方面提供了一种dce-kod dna聚合酶，具体为：在kod dna聚合酶蛋白序列n端融合表达大肠杆菌素ce的突变体dce，且所述dce的核酸序列如seq id no.1～4任一所示。

4、本发明通过在kod dna聚合酶中引入了一种非特异性dna结合蛋白dce，从而显著提高了kod dna聚合酶的特异性扩增效率，其中dce是由大肠杆菌素的c端dna酶结构域(ce2、ce7、ce8、ce9)改造而成，且分别命名为dce2、dce7、dce8、dce9，故发明人将融合koddna聚合酶后所得的融合蛋白命名为dce-kod dna聚合酶。

5、优选地，在上述dce-kod dna聚合酶中，所述kod dna聚合酶蛋白序列来源于thermococcus kodakarensis kod1菌株，其编码基因如seq id no.9所示。

6、更为优选地，在上述dce-kod dna聚合酶中，所述dce-kod dna聚合酶为以下任一：

7、dce2-kod，其氨基酸序列如seq id no.5所示或在seq id no.5所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或

8、dce7-kod，其氨基酸序列如seq id no.6所示或在seq id no.6所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或

9、dce8-kod，其氨基酸序列如seq id no.7所示或在seq id no.7所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或

10、dce9-kod，其氨基酸序列如seq id no.8所示或在seq id no.8所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

11、本发明实施例中提供的dce2-kod、dce7-kod、dce8-kod和dce9-kod的氨基酸序列中均带有纯化标签，需要说明的是，在具体实施过程中，根据实际需求对标签序列进行更换或修改后得到的与本发明dce-kod dna聚合酶功能相同的融合蛋白仍属于本发明的保护范围。

12、本发明第二方面提供了与本发明所述dce-kod dna聚合酶相关的生物材料，包括但不限于以下材料：

13、a)编码本发明所述dce-kod dna聚合酶的基因；

14、b)含有a)所述基因的重组表达载体；

15、c)含有a)所述基因或b)所述重组表达载体的重组细胞。

16、本发明第三方面提供了一种本发明所述dce-kod dna聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

17、s1、根据kod dna聚合酶和dce蛋白的基因序列信息设计并合成引物，通过overlapping pcr技术扩增得到带有纯化标签、酶切位点的dce-kod dna聚合酶基因编码序列；

18、s2、将步骤s1得到的dce-kod dna聚合酶基因片段克隆至表达载体pet23a中构建重组表达载体pet23a-dce-kod；

19、s3、将重组表达载体pet23a-dce-kod转化大肠杆菌，诱导表达得到目的蛋白。

20、优选地，步骤s1所述kod dna聚合酶基因编码序列如seq id no.9所示，所述dce蛋白的基因序列如seq id no.1～4任一所示。

21、本发明第四方面提供了本发明所述dce-kod dna聚合酶在dna复制中的应用，本发明的实验数据表明，相对于天然的kod dna聚合酶，dce-kod dna聚合酶的延伸速率提高了一倍，且对模板的浓度的要求降低了一倍。

22、本发明第五方面提供了本发明所述dce-kod dna聚合酶在制备pcr扩增试剂或试剂盒中的应用。

23、在上述pcr扩增试剂或试剂盒中，还可以包括其他用于pcr扩增的试剂和/或耗材。

24、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

25、(1)本发明对核酸扩增技术中的dna聚合酶进行了分子生物学改造，改造后聚合酶的持续合成能力得到有效提高，并且在重组酶介导的核酸扩增反应中对模板的敏感性有所提高，同时扩增速率也提高了一倍。

26、(2)目前血液或组织样品常常由于样品dna模板浓度太低而很难直接用于pcr检测，通常需要抽提纯的dna样品，而本发明改造后的dna聚合酶对模板具有更高的敏感性，能够显著提高重组酶介导的核酸扩增技术的dna扩增效果，因此有望实现血液或组织样品的直接检测。

27、(3)本发明还提供了改造后聚合酶的具体制备方法和应用方法，为dce-kod dna聚合酶的实际应用奠定了基础。