一种高进行性PfuDNA聚合酶及其制备方法和应用

本发明属于分子生物学和蛋白质工程领域，具体涉及一种高进行性pfudna聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、1986年美国人mullis发明了聚合酶链式反应(pcr)，该技术可在体外高效扩增特定的dna片段。在pcr过程中，双链dna在高温时会变性成为单链；在降温过程中(一般60℃左右)，单链引物遵循碱基互补配对原则结合到单链dna模板的对应区域；随后dna聚合酶在中温条件下沿5’-3’的方向合成互补链。随着taq dna聚合酶在pcr中的应用，pcr技术摆脱了每个循环都需要补充酶的窘境，迎来发展的黄金时期。得益于pcr技术的高效性和高专一性，该技术现已被广泛应用于分子克隆、基因诱变、测序、分子诊断等生命科学和医学领域。

2、目前在pcr中常用的dna聚合酶普遍存在扩增效率低，保真性不够的问题，例如taqdna聚合酶，作为目前pcr中应用最广的一类dna聚合酶，扩增速度约为1kb/min，远低于体内dna合成速度；而且该酶缺乏3’-5’的外切酶活性，扩增的保真性差，能够扩增片段也比较短。与taq dna聚合酶相比，极端嗜热菌pyrococcusfuriosus com1来源的pfu dna聚合酶具有5’-3’的dna聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性，其保真性是taq dna聚合酶的12倍，错误率约为1.4±0.2×10-6。但是前期研究表明，pfu dna聚合酶的延伸速率低于taq dna聚合酶，约为600bp/min。为了提高pfu dna聚合酶扩增效率，研究人员尝试对该酶进行改造。2004年，wang等人将来自于硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)的sso7d与pfu dna聚合酶进行融合表达，获得的融合蛋白phusion的扩增速度提高到2-4kb/min，同时它的保真性也大幅度提高，比taq dna聚合酶高50倍，比pfu dna聚合酶高6倍，目前该酶已经由thermofisher公司商品化。

3、大肠杆菌产生的大肠杆菌素是一类蛋白质毒素，可以杀死亲缘关系比较近的杆菌，其中大肠杆菌素e家族的dna酶包括ce2、ce7、ce8和ce9，是一类非专一性核酸内切酶。有报道表明，4种ce的结构相似，它们的dna酶结构域位于蛋白质分子的c端，约15kda，截短表达的c端结构域具有dna结合和切割能力。在进一步的实验中，对4种ce的c端结构域中参与dna切割的氨基酸进行突变后获得的dce突变体仍保留强的dna结合活性，但不会对dna进行切割。

技术实现思路

1、发明人在前期工作中发现，dce具有很好的热稳定性，故尝试将这4种dce突变体(dce2、dce7、dce8和dce9)与pfu dna聚合酶进行融合表达，以期通过dce与dna的结合活性改善pfu dna聚合酶的酶学性能。

2、本发明的具体技术方案如下:

3、本发明第一方面提供了一种提高pfu dna聚合酶进行性的方法，具体为：通过融合表达大肠杆菌素ce的突变体dce，使得pfudna聚合酶具有更高的进行性和产量。

4、本发明通过在pfu dna聚合酶中引入了一种耐热的、具有dna结合活性但不具有dna切割活性的dce，从而显著有效了pfu dna聚合酶的扩增速度和扩增产量。突变体dce是由大肠杆菌素的c端dna酶结构域(ce2、ce7、ce8、ce9)改造而成，分别被命名为dce2、dce7、dce8、dce9。本发明研究显示，这4种dce均具有提高pfu dna聚合酶延伸速度和扩增产量的功能。

5、本发明第二方面提供了一种高进行性pfu dna聚合酶，具体为：在野生型pfu dna聚合酶蛋白序列n端融合表达大肠杆菌素ce的突变体dce，其中dce为以下任一：

6、dce2，其基因序列如seq id no.2所示；

7、dce7，其基因序列如seq id no.3所示；

8、dce8，其基因序列如seq id no.4所示；

9、dce9，其基因序列如seq id no.5所示。

10、本发明将带有dce标签的pfu dna聚合酶命名为dce-pfu。

11、优选地，在上述高进行性pfu dna聚合酶中，所述野生型pfu dna聚合酶蛋白序列来源于极端嗜热菌pyrococcusfuriosus，且其基因序列如seq id no.1所示。

12、在本发明一实施例中，在极端嗜热菌pyrococcusfuriosus来源的pfu dna聚合酶蛋白序列n端融合表达了突变体dce7，得到了氨基酸序列如seq id no.6所示的dna聚合酶dce7-pfu。本发明实施例中提供的dce7-pfu氨基酸序列中带有纯化标签(his标签)，在具体实施过程中，本领域技术人员根据实际需求对标签序列进行更换或修改后得到的与本发明dce7-pfu功能相同的融合蛋白仍属于本发明的保护范围。

13、本发明第三方面提供了与本发明所述高进行性pfu dna聚合酶相关的生物材料，包括但不限于以下材料：

14、a)编码本发明所述高进行性pfu dna聚合酶的基因；

15、b)含有a)所述基因的重组表达载体；

16、c)含有a)所述基因或b)所述重组表达载体的重组细胞。

17、本发明第四方面提供了一种本发明所述高进行性pfu dna聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

18、s1、合成野生型pfu dna聚合酶和突变体dce的基因序列，通过t5介导的dna克隆方法分步插入pet23a载体，得到重组表达载体pet23a-dce-pfu；

19、s2、将重组表达载体pet23a-dce-pfu转化大肠杆菌，诱导表达得到目的蛋白。

20、优选地，步骤s1所述dce-pfu dna聚合酶基因编码序列如seq id no.1所示，所述dce蛋白的基因序列如seq id no.1～4任一所示。

21、本发明第五方面提供了本发明所述dce-pfu dna聚合酶在dna复制中的应用，具体为：构建含有dce-pfu dna聚合酶、dna模板和引物的反应体系，通过rcr实现dna复制。

22、本发明的实验数据表明，相对于野生型pfu dna聚合酶，dce-pfu dna聚合酶的扩增速度和扩增产量得到显著提高，另外当dce-pfu dna聚合酶为dce7-pfu时，反应体系中最适的k+浓度为16-18mm。

23、本发明第六方面提供了本发明所述dce-pfu dna聚合酶在制备pcr扩增试剂或试剂盒中的应用。

24、在上述pcr扩增试剂或试剂盒中，还可以包括其他用于pcr扩增的试剂和/或耗材。

25、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

26、本发明对核酸扩增技术中的pfu dna聚合酶进行了分子生物学改造，首次发现可以通过融合表达大肠杆菌素ce的突变体dce，显著提高pfudna聚合酶的进行性，为pfudna聚合酶延伸速率低的问题提供了一种新的解决途径；实验结果表明，改造后聚合酶的扩增速度可达到约8kb/min，远高于野生型pfu dna聚合酶(约600bp/min)，同时扩增产量也得到明显提高。本发明还提供了改造后聚合酶的具体制备方法和应用方法，为dce-pfu dna聚合酶的实际应用奠定了基础。