一种稳定剂及其在制备PCR试剂中的应用的制作方法

本发明涉及pcr，具体地，涉及一种稳定剂及其在制备pcr试剂中的应用。

背景技术：

1、聚合酶链反应(polymerase chain reaction)简称pcr，是一种简单、灵敏、快速地体外放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，用于扩增特定的基因片段，目前该技术现已被广泛用于基础研究、疾病检测、农业检测和法医调查等各个领域。

2、目前市场流通的用于基因检测pcr反试剂大部分为各个组分通常分几管分装，且需要进行低温保存和运输，同时在检测前需进行试剂混匀配制，在操作过程中增加环境中气溶胶对扩增体系的污染风险。因此，将液体试剂混合制备成全预混pcr体系是一个很好的选择，可避免混匀配制过程带来的交叉污染，同时操作简便，节约时间。

3、传统核酸诊断试剂因含有生物活性成分(taq聚合酶、反转录酶等)，一般需要在-20℃左右的冷链环境中储运运输，以确保试剂有效成分的生物活性。冷链运输不仅成本高，而且环境温度的变化造成试剂反复冻融也会直接影响检测试剂的性能和保质期。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中pcr试剂中反应体系每次使用都需现配现用，且无法常温运输的技术问题，本发明提供了一种稳定剂及其在制备pcr试剂中的应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于制备pcr试剂的稳定剂。

3、本发明的第二个目的是提供所述稳定剂在制备pcr试剂中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供所述稳定剂在制备pcr预混产品中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种pcr预混液。

6、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

7、糖是最常见、使用最广的一类冻干保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂，在干燥过程中能对蛋白质起到一定的保护作用。糖的保护作用与其及蛋白质的种类有关，而双糖是研究最多也公认最有效的保护剂，其中蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所构成的双糖，化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止蛋白质二级结构改变、干燥处理过程中及贮藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。与蔗糖相比，海藻糖具有更高的玻璃化温度、更低的引湿性、更不具有还原性，这些优点均预示着海藻糖可能具有更广阔的应用前景。

8、甜菜碱是一种从甜菜中发现的生物碱，是胆碱氧化代谢的终产物，是常用的pcr增效剂。甜菜碱可帮助dna聚合酶顺利通过dna某些复杂二级结构，防止dna聚合酶的从模板dna中解离。甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性。浓度依赖性降低高gc含量序列的tm，并使pcr两引物的tm相接近，最终降低dna tm值。高浓度的甜菜碱溶液可稳定dna-蛋白复合物。

9、polyethylene glycol(peg)，即聚乙二醇，一种氧化乙烯和水的聚合物，在生化实验中，具有多种用途，包括：1)活化后可以结合多肽或蛋白质，用于沉淀蛋白；2)作为一种融合剂强化巨噬细胞杂交瘤的形成；3)分离纯化生物大分子；4)诱导细胞杂交等。另外，peg具有广泛的化学相容性，是非常好的溶剂和增溶剂，常作为冻干试剂的填充剂，还普遍用在工业、医疗等领域。

10、本发明通过将pcr反应体系中各组分混合在一起，并添加特殊的可风干稳定剂，放在烘箱进行处理后，使pcr反应试剂达到一定的失水率，从而使pcr试剂由溶液状态达到胶质状态。

11、一种用于制备pcr试剂的稳定剂，包含工作浓度为0.05m～0.25m的甜菜碱、工作浓度为0.05m～0.25m的海藻糖、工作浓度为0.1mm～0.5mm的葡聚糖和工作浓度为0mm～9mm的peg8000。

12、优选地，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m～0.2m。

13、更优选地，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m、0.1m、0.2m或0.13m。

14、优选地，所述海藻糖的工作浓度为0.08m～0.2m。

15、更优选地，所述海藻糖的工作浓度为0.08m、0.17m或0.2m。

16、优选地，所述葡聚糖的工作浓度为0.15mm～0.4mm。

17、更优选地，所述葡聚糖的工作浓度为0.17mm或0.33mm。

18、优选地，所述peg8000的工作浓度为0mm～9mm。

19、更优选地，所述peg8000的工作浓度为0mm、1.67mm或6.67mm。

20、进一步优选地，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m，所述海藻糖的工作浓度为0.08m，所述葡聚糖的工作浓度为0.17mm，所述peg8000的工作浓度为1.67mm。

21、进一步优选地，所述甜菜碱的工作浓度为0.1m，所述海藻糖的工作浓度为0.17mm，所述葡聚糖的工作浓度为0.33mm，所述peg8000的工作浓度为6.67mm。

22、进一步优选地，所述甜菜碱的工作浓度为0.2m，所述海藻糖的工作浓度为0.2m，所述葡聚糖的工作浓度为0.33mm，所述peg8000的工作浓度为0mm。

23、进一步优选地，所述甜菜碱的工作浓度为0.13m，所述海藻糖的工作浓度为0.17m，所述葡聚糖的工作浓度为0.08mm，所述peg8000的工作浓度为6.67mm。

24、最优选地，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m，所述海藻糖的工作浓度为0.08m，所述葡聚糖的工作浓度为0.17mm，所述peg8000的工作浓度为1.67mm。

25、任一所述稳定剂在制备pcr试剂中的应用也应在本发明的保护范围之内。

26、任一所述稳定剂在制备pcr预混产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

27、一种pcr预混液，包含任一所述的稳定剂、dntps、pcr反应酶和pcr反应buffer。

28、优选地，所述稳定剂中，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m～0.2m。

29、更优选地，所述稳定剂中，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m、0.1m、0.2m或0.13m。

30、优选地，所述稳定剂中，所述海藻糖的工作浓度为0.08m～0.2m。

31、更优选地，所述稳定剂中，所述海藻糖的工作浓度为0.08m、0.17m或0.2m。

32、优选地，所述稳定剂中，所述葡聚糖的工作浓度为0.15mm～0.4mm。

33、更优选地，所述稳定剂中，所述葡聚糖的工作浓度为0.17mm或0.33mm。

34、优选地，所述稳定剂中，所述peg8000的工作浓度为0mm～9mm。

35、更优选地，所述稳定剂中，所述peg8000的工作浓度为0mm、1.67mm或6.67mm。

36、进一步优选地，所述稳定剂中，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m，所述海藻糖的工作浓度为0.08m，所述葡聚糖的工作浓度为0.17mm，所述peg8000的工作浓度为1.67mm。

37、进一步优选地，所述稳定剂中，所述甜菜碱的工作浓度为0.1m，所述海藻糖的工作浓度为0.17mm，所述葡聚糖的工作浓度为0.33mm，所述peg8000的工作浓度为6.67mm。

38、进一步优选地，所述稳定剂中，所述甜菜碱的工作浓度为0.2m，所述海藻糖的工作浓度为0.2m，所述葡聚糖的工作浓度为0.33mm，所述peg8000的工作浓度为0mm。

39、进一步优选地，所述稳定剂中，所述甜菜碱的工作浓度为0.13m，所述海藻糖的工作浓度为0.17m，所述葡聚糖的工作浓度为0.08mm，所述peg8000的工作浓度为6.67mm。

40、最优选地，所述稳定剂中，所述甜菜碱的工作浓度为0.05m，所述海藻糖的工作浓度为0.08m，所述葡聚糖的工作浓度为0.17mm，所述peg8000的工作浓度为1.67mm。

41、优选地，所述稳定剂在所述pcr预混液中的含量为15％v/v～25％v/v。

42、更优选地，所述稳定剂在所述pcr预混液中的含量为20％v/v。

43、优选地，所述dntps的终浓度为0.2mmol/l～0.5mmol/l。

44、更优选地，所述dntps的终浓度为2mmol/l。

45、进一步优选地，所述dntps包括终浓度为0.4mmol/l datp、终浓度为0.4mmol/ldttp、终浓度为0.4mmol/l dctp、终浓度为0.4mmol/l dgtp和终浓度为0.4mmol/l dutp。

46、更优选地，所述pcr反应酶包括终浓度为0.06u/μl～0.24u/μl的热启动taq抗体酶、终浓度为0.06u/μl～0.24u/μl的taq酶和终浓度为0.01u/μl～0.04u/μl的udg酶。

47、进一步优选地，热启动taq抗体酶终浓度为0.12u/μl。

48、进一步优选地，taq酶终浓度为0.12u/μl。

49、进一步优选地，udg酶终浓度为0.02u/μl。

50、更进一步优选地，所述pcr反应酶还包括终浓度为3.6％v/v的稀释液，所述稀释液的主要成分为：tris-hcl，ph 9.0，15mm；kcl，100mm；乙二胺四乙酸(edta)，ph 8.0，0.1mm；tween-20，0.5％v/v；乙基苯基聚乙二醇(np-40)，4ml；二硫苏糖醇(dtt)，1mm；丙三醇(甘油)，50％v/v。

51、更优选地，所述pcr反应buffer为4×buffer～7×buffer。

52、进一步优选地，所述pcr反应buffer为6×buffer。

53、进一步优选地，所述pcr反应buffer包括终浓度为0.06mol/l的tris-hcl ph8.8、终浓度为0.01mol/l的(nh4)2so4、终浓度为0.003mol/l的mgcl2和终浓度为0.05mol/l的kcl。

54、更进一步优选地，所述pcr反应buffer还包括终浓度为0.4％v/v的tween-20。

55、优选地，所述pcr预混液还包含pcr引物和/或pcr探针。本发明对pcr引物和pcr探针的序列没有限定，用于进行pcr反应的引物和探针均可实现本发明的目的。

56、更优选地，所述pcr引物的终浓度为0.2pmol/μl～0.5pmol/μl。

57、进一步优选地，所述pcr引物包含检测b群链球菌的pcr引物。

58、更进一步优选地，所述检测b群链球菌的pcr引物的靶标为camp基因，所述camp基因的ncbi基因号为x72754.1。

59、再进一步优选地，所述检测b群链球菌的pcr引物的核苷酸序列如seq id no：1～2所示，终浓度各为0.33pmol/μl。

60、进一步优选地，所述pcr引物还包含检测gapdh基因的引物，所述gapdh基因的ncbi基因号为ng_007073.2。

61、更进一步优选地，所述检测gapdh基因的引物核苷酸序列如seq id no：4～5所示，终浓度各为0.5pmol/μl。

62、进一步优选地，所述pcr引物包含检测hsv-ⅱ的pcr引物。

63、更进一步优选地，所述检测hsv-ⅱ的pcr引物的靶标为糖蛋白g基因，所述糖蛋白g基因的ncbi基因号为eu018103.1。

64、再进一步优选地，所述检测hsv-ⅱ的pcr引物的核苷酸序列如seq id no：8～9所示，终浓度各为0.33pmol/μl。

65、进一步优选地，所述pcr引物还包含检测ppia基因的引物。

66、更进一步优选地，所述检测ppia基因的引物核苷酸序列如seq id no：11～12所示，终浓度各为0.5pmol/μl。

67、更优选地，所述pcr探针的终浓度为0.1pmol/μl～0.4pmol/μl。

68、更进一步优选地，所述检测b群链球菌的pcr探针的靶标为camp基因，所述camp基因的ncbi基因号为x72754.1。

69、再进一步优选地，所述检测b群链球菌的pcr探针的核苷酸序列如seq id no：3所示，终浓度为0.167pmol/μl。

70、进一步优选地，所述pcr探针还包含检测gapdh基因的探针，所述gapdh基因的ncbi基因号为ng_007073.2。

71、更进一步优选地，所述检测gapdh基因的探针核苷酸序列如seq id no：6所示，终浓度为0.267pmol/μl。

72、进一步优选地，所述pcr探针包含检测hsv-ⅱ的pcr探针。

73、更进一步优选地，所述检测hsv-ⅱ的pcr探针的靶标为糖蛋白g基因，所述糖蛋白g基因的ncbi基因号为eu018103.1。

74、再进一步优选地，所述检测hsv-ⅱ的pcr探针的核苷酸序列如seq id no：10所示，终浓度各为0.167pmol/μl。

75、进一步优选地，所述pcr探针还包含检测ppia基因的探针。

76、更进一步优选地，所述检测ppia基因的探针核苷酸序列如seq id no：13所示，终浓度各为0.267pmol/μl。

77、优选地，所述pcr预混液还包含tris-edta缓冲液。

78、进一步优选地，所述tris-edta缓冲液的终浓度为2.00％v/v～4.00％v/v。

79、更进一步优选地，所述tris-edta缓冲液的终浓度为2.47％v/v。

80、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

81、本发明将特定的pcr稳定剂与常规pcr反应组分(如引物、探针、热启动taq抗体酶、taq酶、udg酶、pcr反应buffer、tris hcl、dntps等)混充分混合，制得pcr全组分预混预混体系，显著提高了pcr试剂在的稳定性，一管体系，分装即可加样检测，无需进行配制体系，操作简便，随取随用，省时省力。