一种鸡多能干细胞体外培养方法

本发明涉及一种鸡多能干细胞体外培养方法，属于畜牧学和生物。

背景技术：

1、胚胎干细胞是通过分离内细胞团细胞或早期胚胎的原始生殖细胞，在体内外合适的条件下抑制分化培养得到的具有无限增殖能力，能进行自我更新，具有分化为包括生殖系细胞在内的多种细胞的潜能的未分化细胞。已在组织工程、再生医学、药物筛选、毒性测试、基因功能研究等领域得到广泛应用。然而，由于不同物种的独特遗传特征，pscs的培养系统存在显著差异。在鸡上尚未建立稳定高效的鸡pscs培养体系。因此，本发明在鸡pscs的培养体系上进行的研究尝试了各种不同的培养基、饲养层、条件培养基、生长因子、血清、血清替代物和小分子化合物，找到了一种高效且广泛适用的鸡pscs培养系统，经过体外培养后，鸡pscs仍能够保持其多能性和分化潜能。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术存在的问题，提供一种鸡多能干细胞体外培养方法，为鸡pscs的高效培养和多能性维持提供新方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种鸡多能干细胞体外培养方法，所述方法包括以下步骤：

3、步骤1，配制鸡kosr培养基；

4、步骤2，配制fix培养基：在鸡kosr培养基中添加fgf2、iwr-1和xav-939，配制成鸡多能干细胞pscs培养基fix；

5、步骤3，制备sto饲养层细胞：sto细胞生长至80％汇合度时，用丝裂霉素c处理，然后冻存在液氮中以备后用；

6、步骤4，解冻灭活的sto饲养层细胞，并接种在培养皿上；

7、步骤5，鸡pscs的分离培养：分离鸡胚盘明区细胞在铺有sto饲养层细胞并加入fix培养基的培养皿中进行培养扩增。

8、进一步地，步骤1中鸡kosr培养基由ko-dmem、15％ knockout血清替代剂、0.2％鸡血清、1×b-27补充剂、1×n-2补充剂、1×glutamax、1×neaa、0.1mmβ-巯基乙醇、1×embryomax核苷、1mm丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素组成。

9、进一步地，步骤2中fgf2的浓度为4.0ng/ml，iwr-1的浓度为2μm，xav-939的浓度为2.5μm。

10、进一步地，步骤3具体为：sto细胞生长至80％汇合度时，用10μg/ml的丝裂霉素c处理2h，然后冻存在液氮中以备后用。

11、进一步地，步骤4中在进行鸡pscs培养的前一天，解冻灭活的sto饲养层细胞，并以2×104个/cm2接种在0.1％明胶包被的培养皿上。

12、进一步地，步骤5具体步骤为：收集新鲜的鸡种蛋，并用70％乙醇消毒；用镊子敲开蛋壳，暴露出胚盘；将消毒并干燥的滤纸环放在胚盘上，然后用剪刀沿滤纸环的外缘切开将胚盘与蛋黄分离，用镊子夹住滤纸，连同胚盘一起翻转过来，使其与蛋黄分离；在培养皿中用pbs洗涤去除蛋黄，然后在显微镜下使用注射针头分离出胚盘明区中的细胞bcs；通过轻轻吹打使bcs分散形成细胞悬液，然后以1500转/min的速度离心5min，使细胞沉淀；加入fix培养基，将每个胚胎的bcs接种在铺有灭活sto饲养层的培养皿中，每天更换培养基；经过2-3天后，形成psc克隆，并用accutase酶对形成的psc克隆消化5-7min，然后接种在新的铺有sto细胞的培养皿中进行传代。

13、本发明具有以下技术效果：(1)本发明提供的鸡pscs培养体系和体外培养方法可促进鸡胚盘明区细胞形成pscs样克隆，并使其快速增殖，以满足pscs的需求。经过体外培养后，鸡pscs仍能够保持其多能性和分化潜能，有利于后续实验和研究的进行。

14、(2)本发明中使用的fix培养体系中，添加的细胞因子、小分子化合物、血清替代物等添加剂成份明确，使用的sto细胞为标准化生产的细胞系。因此，该培养体系在其他实验室也具有很好的推广和应用价值。本发明提供的培养体系和方法为研究鸡pscs的生物学特性提供了可靠的材料和手段。该方法为鸡的良种扩繁、基因修饰、种质资源保存等方面提供了新的方法和实验基础，具有重要的应用潜力。

技术特征：

1.一种鸡多能干细胞体外培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的鸡多能干细胞体外培养方法，其特征在于，步骤1中鸡kosr培养基由ko-dmem、15％knockout血清替代剂、0.2％鸡血清、1×b-27补充剂、1×n-2补充剂、1×glutamax、1×neaa、0.1mmβ-巯基乙醇、1×embryomax核苷、1mm丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素组成。

3.根据权利要求1所述的鸡多能干细胞体外培养方法，其特征在于，步骤2中fgf2的浓度为4.0ng/ml，iwr-1的浓度为2μm，xav-939的浓度为2.5μm。

4.根据权利要求1所述的鸡多能干细胞体外培养方法，其特征在于，步骤3具体为：sto细胞生长至80％汇合度时，用10μg/ml的丝裂霉素c处理2h，然后冻存在液氮中以备后用。

5.根据权利要求1所述的鸡多能干细胞体外培养方法，其特征在于，步骤4中在进行鸡pscs培养的前一天，解冻灭活的sto饲养层细胞，并以2×104个/cm2接种在0.1％明胶包被的培养皿上。

6.根据权利要求1所述的鸡多能干细胞体外培养方法，其特征在于，步骤5具体步骤为：收集新鲜的鸡种蛋，并用70％乙醇消毒；用镊子敲开蛋壳，暴露出胚盘；将消毒并干燥的滤纸环放在胚盘上，然后用剪刀沿滤纸环的外缘切开将胚盘与蛋黄分离，用镊子夹住滤纸，连同胚盘一起翻转过来，使其与蛋黄分离；在培养皿中用pbs洗涤去除蛋黄，然后在显微镜下使用注射针头分离出胚盘明区中的细胞bcs；通过轻轻吹打使bcs分散形成细胞悬液，然后以1500转/min的速度离心5min，使细胞沉淀；加入fix培养基，将每个胚胎的bcs接种在铺有灭活sto饲养层的培养皿中，每天更换培养基；经过2-3天后，形成psc克隆，并用accutase酶对形成的psc克隆消化5-7min，然后接种在新的铺有sto细胞的培养皿中进行传代。

技术总结
本发明公开一种鸡多能干细胞体外培养方法，属于畜牧学和生物技术领域；通过添加FGF2、IWR‑1和XAV‑93，并以STO细胞为饲养层，建立FIX培养体系，从鸡新鲜种蛋EGK.X期分离胚盘明区细胞，在FIX培养体系中，采用5%CO<subgt;2</subgt;、饱和湿度的37℃培养箱进行培养，每天更换培养液，每2‑3天传代一次，进行鸡多能干细胞PSCs体外培养；本发明提供的方法可以在短期内使鸡PSCs快速增殖，且维持其多能性和分化潜能；为研究鸡PSCs生物学特性提供了材料，为家禽的良种扩繁、基因修饰、家禽分子设计育种和种质资源冷冻保存等提供了新的方法、奠定了实验基础。

技术研发人员：牛英杰,吴骏,任文杰,刘广政,李碧春,韩威,李国辉,靳锴,左其生,张亚妮,陈国宏
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12