一种促进植物花青素积累的基因bHLH35及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种促进植物花青素积累的基因bhlh35及其应用。

背景技术：

1、花青素(anthocyanidins)，又名花色苷，是植物体内分布广泛的重要次生代谢产物，主要以水溶形式存储在植物细胞液泡中，其种类繁多，可使植物体呈现不同的色彩(liet al.,2022)。花青素可作为食用色素，在我国具有悠久的使用历史。随着对其研究的深入，发现花青素广泛参与了植物生长发育过程以及胁迫反应，如：参与响应干旱、盐碱、极端温度、紫外损伤等非生物胁迫；参与抗病、抗虫害等生物胁迫；参与花、果实颜色的形成，吸引昆虫、鸟对其进行花粉和种子传播等。花青素具有很强的抗氧化能力，近年来被广泛用于食品医疗行业，如：心脑血管疾病的预防和辅助治疗；用于改善血糖平衡和抗癌治疗中(butelli et al.,2008；sun et al.,2013；kaur et al.,2023；alappat andalappat,2020)。

2、半荷包紫堇(corydalis hemidicentra)为主要分布于横断山脉高山流石滩的多年生草本植物。其生境海拔高度高，紫外辐射强，年平均气温在-4℃以下且昼夜温差大。同时，该地区的寡食性绢蝶主要依赖视觉定位紫堇并将其卵产至植株就近石头上，新孵化出的幼虫以紫堇叶片为食(niu et al.,2014)。为了适应极端恶劣的环境以及躲避天敌绢蝶的产卵，一些居群的紫堇产生了丰富的颜色变异，半荷包紫堇的颜色变异范围可从灰白色至灰红或深灰色，使其与生长地点的砾石颜色相近。半荷包紫堇叶表皮细胞中花青素和叶绿素的组成和含量的差异构成其叶片颜色变异的生理生化基础(niu et al.,2017)。具有伪装特性的灰色叶片花青素含量远高于叶绿素含量，使该居群个体能够更好地抵御高寒高紫外环境以及伪装自己。

3、转录因子是一类能够与其靶基因中特定序列结合，并调控该基因转录水平的蛋白。碱性/螺旋-环-螺旋(bhlh)转录因子在不同植物物种中均有分布，是植物体中第二大类转录因子家族。该家族成员共享两个大约60个氨基酸的保守结构域：参与结合dna的碱性区域(b)，能够特异识别靶基因的调控元件e-box(canntg)或g-box(cacgtg)和能够形成同源或异源二聚体的两个疏水α螺旋与氨基酸环结构域(hlh)。他们在拟南芥中被划分为明确的12个亚家族：bhlh i至bhlh xii(hao etal.,2021)。该家族成员广泛参与植物生长发育过程以及胁迫反应，如：蓝光可以提高油菜素内酯增强表达蛋白1(bee1，bhlh44)的稳定性来系统性调控光周期介导的植物开花过程(wang et al.,2019)；atbhlh57和种子休眠相关蛋白odr1形成复合体抑制aba生物合成相关酶nced转录，减少内源aba含量，从而解除种子休眠(liu et al.,2020)；在拟南芥中异源表达胡杨pebhlh35可以减少其叶片气孔密度和开度来降低蒸腾速率从而提高转基因拟南芥抗旱性(dong et al.,2014)；bhlh转录因子ice1在冷害发生早期转录激活cbfs表达从而激活下游抗冻基因的表达，提高植物的抗冻性(leeet al.,2005)。在应对外界胁迫中，植物体通常也合成一些专门的代谢产物来提高自身的抗性，花青素为其中一种重要的次生代谢产物，植物体主要使用myb-bhlh-wdr(mbw)三元复合体来调节花青素的合成(xu et al.,2015)，如：在棉花中过表达r2r3-myb转录因子ghpap1d增加了其光诱导下的花青素含量，从而增强了转基因棉花对棉铃虫和蜘蛛螨的抗性(li et al.,2019)；番茄bhlh转录因子sljaf13通过激活mbw复合体中sian1的表达，促进花青素在其果实的积累(chen etal.,2022)；bhlh基因除对下游花青素合成基因起激活作用外，还存在负调节现象：在拟南芥中过表达腊梅cpbhlh1基因导致其花青素积累减少(zhao et al.,2020)。

4、本技术发明人在研究半荷包紫堇颜色变异时从其灰色居群中分离得到了一个高表达的chbhlh35基因；同时在亲缘关系较远的拟南芥中也分离了其直系同源基因atbhlh35，拟南芥或其他任何植物的该基因在调控花青素合成的相关功能均没有报道。将两个物种的bhlh35过表达至拟南芥、生菜中均能显著提高植株的花青素含量。本技术发明人过表达半荷包紫堇和拟南芥的两个直系同源基因bhlh35创制了几种高花青素含量的植株，后期可用于抗虫和具有抗氧化衰老保健功效的农作物育种以及其他动植物中。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中的上述问题，提供一种促进植物花青素积累的基因bhlh35及其应用。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供了一种促进植物花青素积累的基因bhlh35，所述基因bhlh35为半荷包紫堇chbhlh35基因、拟南芥atbhlh35基因或其他被子植物直系同源基因(序列相似度在半荷包紫堇chbhlh35基因和拟南芥atbhlh35基因二者之间，或与两者相似，序列区别在5％之内)；所述半荷包紫堇chbhlh35基因的核苷酸序列见seq id no：1所示；所述半荷包紫堇chbhlh35基因的氨基酸序列见seq id no：2所示；所述拟南芥atbhlh35基因的核苷酸序列见seq id no：3所示；所述拟南芥atbhlh35基因的氨基酸见seq id no：4所示。

4、进一步地，所述植物为被子植物。

5、本发明还提供了上述所述的一种促进植物花青素积累的基因bhlh35在高花青素含量的转基因植物育种中的应用。

6、本发明还提供了上述所述的一种促进植物花青素积累的基因bhlh35在耐非生物胁迫环境的转基因植物育种中的应用。

7、本发明还提供了上述所述的一种促进植物花青素积累的基因bhlh35在耐生物胁迫环境的转基因植物育种中的应用。

8、本发明还提供了一种培育高花青素含量和耐生物、非生物胁迫环境的转基因植物的方法，其特征是：所述方法包括如下步骤：

9、将上述所述基因bhlh35通过基因工程手段转入到植物中，获得高花青素含量和耐生物、非生物胁迫环境的转基因植物。

10、以下本发明方案涉及的序列：

11、seq id no：1(半荷包紫堇chbhlh35(cheg0011994.1))基因的核苷酸序列)：

12、atggaacacattgatgaagactacaaacattactgggaaacaaaaatgttttttcaaaatgaagaactcgacagtttggtttacgacgagcaaatttccggttacgacgagcaagtttcgggttactatgattcgagctctccggacgcttcatcggtcacagcgaaaaatataatttcagaaagaaataggaggaaaaaacttaatgatagattatttgcattaagagctgtggttcctaatattagcaagatggataaagcatcgataattaaggacgcgatcgagtacatccaagaattacacgaacaagaacgagcaatccaagtagagttaattgagctcgaatcggggaaattgaagaaacccatgttggatatcgaacgacaaaatgcaggtttattgaagacgaagaaaaagagaatagatactaattatgattcgagtggatcgagatcgtcatcgatcgaattgctagagcttagagtttcgtacgtgggagatagaactatggtggtaagtctcacgtgcgataaaaaaacagacacaatggtgaagctctgtgaagttttcgagtctttgaagcttaaaatagtcactgcaagtatcactgttttctcagggagacttctcaagactgtctttgtcgaggtaatttactaa。

13、seq id no：2(成)：

14、mehidedykhywetkmffqneeldslvydeqisgydeqvsgyydssspdassvtakniisernrrkklndrlfalravvpniskmdkasiikdaieyiqelheqeraiqvelielesgklkkpmldierqnagllktkkkridtnydssgsrsssiellelrvsyvgdrtmvvsltcdkktdtmvklcevfeslklkivtasitvfsgrllktvfveviy。

15、seq id no：3(拟南芥bhlh35(at5g57150)基因的核苷酸序列)：

16、atggaggatatcgtcgaccaagaattaagcaattactgggaacctagctccttcctccaaaacgaagacttcgaatacgacagaagctggcctttggaagaagccatttctgggtcgtatgattcgagttcgccggatggagctgcttcgtcgccggcttctaagaatattgtgtcggagagaaacagaagacagaaacttaaccagagactcttcgctcttcgatcagttgttcccaatatcactaagatggataaagcctcaataatcaaagatgctattagttacatagaaggattacaatatgaagaaaagaagctcgaagctgagatcagagaacttgaatctacaccaaagagtagccttagtttcagcaaagattttgatcgtgatttacttgttcctgtcacatccaagaagatgaagcagcttgattctggttcttccacttctctcatcgaagttctcgaattgaaggtaacattcatgggagagaggacaatggtggtgagtgtaacatgtaataagaggacagatacaatggtgaaactgtgtgaagtctttgagtcattgaatctcaaaatcctcacttccaatctcacctctttctctggcatgatcttccacactgtctttattgagttgcgaccaaacatttattgggttgtgtggtttttagtttttatgtctatttttggtcccacaattattgtaatttggtccatttggtttattaaaaagaaaataatattatctctgtggcggatgaagaagaacaagaggtgttgcggttaa。

17、seq id no：4(拟南芥bhlh35基因的氨基酸序列)：

18、medivdqelsnywepssflqnedfeydrswpleeaisgsydssspdgaasspasknivsernrrqklnqrlfalrsvvpnitkmdkasiikdaisyieglqyeekkleaeirelestpksslsfskdfdrdllvpvtskkmkqldsgsstslievlelkvtfmgertmvvsvtcnkrtdtmvklcevfeslnlkiltsnltsfsgmifhtvfielrpniywvvwflvfmsifgptiiviwsiwfikkkiilslwrmkknkrccg。

19、与现有技术相比，本方案的有益效果：

20、本发明的方案提供了促进植物花青素积累的基因bhlh35及其在转基因植物育种中的应用，本发明分离出的半荷包紫堇chbhlh35基因和拟南芥atbhlh35，是一种能够促进植物体花青素积累的bhlh类转录因子；并且，通过基因工程手段获得的chbhlh35和atbhlh35转基因拟南芥、生菜均表现出较高的花青素积累；本发明的该基因的发现及其应用对于培育抗虫和具有抗氧化衰老保健功效的农产品具有重要的理论及实践意义。