一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌BL-H4P及其驯化发酵方法、菌剂和应用与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p及其驯化发酵方法、菌剂和应用。

背景技术：

1、乳双歧杆菌（ bifidobacterium lactis），是一种益生菌，通常被称为乳酸菌或乳酸双歧杆菌，其是一类对人体有益的细菌，常见于发酵食品如酸奶和乳酸发酵的蔬菜中。乳双歧杆菌主要包括两种主要类型：拉氏乳双歧杆菌（ lactobacillus acidophilus）和布氏乳双歧杆菌（ bifidobacterium bifidum）。这些菌在肠道中发挥着重要的作用，支持消化系统的健康，维持肠道菌群的平衡，有助于防止有害细菌的生长，促进免疫系统的正常功能，帮助营养吸收，减轻消化不适，以及对一些肠道疾病的预防和治疗具有积极影响。

2、多项研究表明，乳双歧杆菌具有降低血清胆固醇、降低血脂以及提高机体免疫力的功效。例如，中国专利申请cn112592874a公开一种降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌jyla-191及其应用，该嗜酸乳杆菌jyla-191菌体可以和肠道内的胆固醇相结合，减慢胆固醇的吸收，降低血液中脂蛋白的形成速度，减少循环系统中存在的胆固醇的含量；中国另一专利申请cn113832058a公开乳双歧杆菌bla80在制备降血脂和调节肠道菌群的药物或食品中的应用，提及乳双歧杆菌bla80可广泛应用于食品领域及微生物制剂，通过日常摄入而不需要通过药物达到调节肠道菌群、降低血脂的目的。

3、由于高胆固醇、高血脂是引起冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的最主要因素之一，传统的药物治疗存在一定的副作用，随着人们健康意识的提高，越来越多的人更倾向于通过改善饮食、食用益生菌等方式来降低血清胆固醇及血脂。因此挖掘益生菌的降胆固醇及降低血脂的特性成为近些年研究的热点。

4、然而，乳双歧杆菌在进入小肠之前需要通过胃酸和胃液的环境，一些菌株对胃酸的耐受性较差，在胃部会失去活性，从而影响其在肠液中的进一步存活。且肠液中的胰蛋白酶等活性物质也会对益生菌产生影响，导致一些菌株的生长受到抑制。因此，提升具有降胆固醇作用的乳双歧杆菌的耐受性，使其更好的适用生存环境，以获得更好的降胆固醇中的表现，是至关重要的一环。

技术实现思路

1、针对上述提到的问题及为了达到上述的目的，本发明提供一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p（ bifidobacterium lactisbl-h4p）及其驯化发酵方法、菌剂和应用，将从健康人的肠道中分离出原始菌种驯化后，成功获得更能耐受胃酸和肠液能力的菌种，以用于降低胆固醇。具体技术方案如下：

2、首先，本发明提供一种乳双歧杆菌bl-h4p，该菌株于2022年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），地址：中国，武汉，武汉大学，该菌株分类命名为乳双歧杆菌（ bifidobacterium lactisbl-h4p），保藏编号为cctcc no：m 20221559。

3、前述的乳双歧杆菌bl-h4p，其基因序列如seq no.1所示。

4、其次，本发明提供一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，将从健康人的肠道中分离出的原始乳双歧杆菌菌种置于含有一定浓度酒精的驯化培养基中进行多轮胁迫培养驯化，获得降胆固醇耐胃酸及肠液的菌株乳双歧杆菌bl-h4p，其保藏编号为cctcc no：m 20221559。

5、前述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，所述驯化培养基中的酒精体积分数浓度为4%～8%。

6、前述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，所述驯化培养基为降糖的mrs肉汤培养基，其糖份含量为原培养基的20%，并调整其ph为6.0，其他成份不变。

7、前述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，所述乳双歧杆菌培养基组分为，包括：葡萄糖23g/l，酵母浸粉10g/l，酵母蛋白胨10g/l，大豆蛋白胨10g/l，低聚半乳糖5g/l，无水乙酸钠5g/l，吐温80 1g/l，柠檬酸氢二铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁 0.2g/l，一水硫酸锰0.04g/l，l-半胱氨酸盐酸盐1g/l，余量为纯化水，ph调节至7.1±0.1，115℃灭菌30min。

8、前述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，该驯化共为五轮，其驯化的培养方式为：将对数生长期的菌种接种于含有酒精的驯化培养基中，做好标记，置于菌种最适温度环境下静止培养24～48小时；每轮酒精胁迫后，测定菌液的od600值，确定菌液活性，然后收集菌种进行保藏及鉴定。

9、再次，本发明提供一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的发酵方法，该方法为用于培养发酵前述的的乳双歧杆菌bl-h4p；具体发酵过程为：将-80℃保藏的甘油菌划线接种于mrs固体培养基上复苏，37℃下培养36～48h后，挑取菌点接种于乳双歧杆菌液体培养基上进行活化处理，再于37℃下培养18～24h，用酶标仪测定其od600值；然后进行扩大发酵培养，发酵条件为：取5ml接入到1000ml乳双歧杆菌液体培养基中，37℃下，培养12～18h；再用酶标仪测定其od600值，并检测其活菌数据。

10、另外，本发明还提供一种菌剂，该菌剂含有前述的乳双歧杆菌bl-h4p。

11、最后，本发明提供一种前述的乳双歧杆菌bl-h4p的应用，即在制备用于降胆固醇制剂的中的应用。

12、本发明的有益效果：

13、1）本发明从健康人的肠道中分离出原始菌种后，将其置于制造的胁迫环境中进行驯化，获得了一种新的乳双歧杆菌菌株h4p（ bifidobacterium lactisbl-h4p），增加了耐受胃酸和肠液的能力，作为菌种降低胆固醇益生菌，具有更好的疗效和表现。

14、2）本发明驯化方法，首次采用酒精刺激的方式对原始菌种进行胁迫驯化，使获得的菌种可适应恶劣的生长环境，增加其对胃酸和肠液的耐受能力，保持较高的活性，提升降低胆固醇的效果和表现。

15、3）本发明驯化方法共进行了5轮，驯化效果明显，且获得了较好的发酵培养条件，为驯化获得的菌种大规模发酵培养创造了合适的条件，利于后期的生产。

16、4）本发明驯化获得的菌株来源于健康人体肠道，对人体无毒副作用，测序分析发现，该菌株无毒力基因，相对于目前用于降胆固醇类的传统药物具有极大的优势。

技术特征：

1.一种乳双歧杆菌bl-h4p，其特征在于：该乳双歧杆菌（bifidobacterium lactis bl-h4p）的保藏编号为cctcc no：m 20221559。

2.根据权利要求1所述的乳双歧杆菌bl-h4p，其特征在于：其基因序列如seq no.1所示。

3.一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，其特征在于：将从健康人的肠道中分离出的原始乳双歧杆菌菌种置于含有一定浓度酒精的驯化培养基中进行多轮胁迫培养驯化，获得降胆固醇耐胃酸及肠液的菌株乳双歧杆菌bl-h4p，该菌株的保藏编号为cctcc no：m 20221559。

4.根据权利要求3所述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，其特征在于：所述驯化培养基中的酒精体积百分比浓度为4%～8%。

5.根据权利要求4所述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，其特征在于：所述驯化培养基为降糖的mrs肉汤培养基，其糖份含量为原培养基的20%，并调整其ph为6.0，其他成份不变。

6.根据权利要求5所述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，其特征在于：所述乳双歧杆菌液体培养基组分为，包括：葡萄糖23g/l，酵母浸粉10g/l，酵母蛋白胨10g/l，大豆蛋白胨10g/l，低聚半乳糖5g/l，无水乙酸钠5g/l，吐温80 1g/l，柠檬酸氢二铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁 0.2g/l，一水硫酸锰0.04g/l，l-半胱氨酸盐酸盐1g/l，余量为纯化水，ph调节至7.1±0.1，115℃灭菌30min。

7.根据权利要求3所述的降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的驯化方法，其特征在于：该驯化共为五轮，其驯化的培养方式为：

8.一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌bl-h4p的发酵方法，其特征在于：该方法为用于培养发酵权利要求1或2所述的乳双歧杆菌bl-h4p，或用于培养发酵权利要求3-7任一项所述方法驯化的乳双歧杆菌bl-h4p；具体发酵过程为：

9.一种菌剂，其特征在于：该菌剂含有权利要求1或2所述的乳双歧杆菌bl-h4p，或含有权利要求3-7任一项所述方法驯化的乳双歧杆菌bl-h4p。

10.权利要求1或2所述的乳双歧杆菌bl-h4p，或权利要求3-7任一项所述方法驯化的乳双歧杆菌bl-h4p的应用，其特征在于：在制备用于降胆固醇制剂的中的应用。

技术总结
本发明公开一种降胆固醇耐胃酸及肠液的乳双歧杆菌BL‑H4P及其驯化发酵方法、菌剂和应用，该乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis BL‑H4P）的保藏编号为CCTCC NO：M 20221559。该菌株为从健康人的肠道中分离出原始菌种经酒精胁迫驯化获得，其具有良好的耐受胃酸和肠液的能力，作为菌种降低胆固醇益生菌，具有更好的疗效和表现；且测序分析发现，该菌株无毒力基因，相对于目前用于降胆固醇类的传统药物具有极大的优势。

技术研发人员：王林,王永胜,许登泉
受保护的技术使用者：镇江市远胜生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27