一种优化的5`UTR序列及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和核酸药物领域，具体地，涉及一种优化的5'utr序列及其应用。

背景技术：

1、基于mrna的治疗方法，在实际应用中较为精准且可用于个体化治疗，因此是现代医学发展的新方向。与哺乳动物细胞系中表达的重组蛋白相比，mrna的生产更快、更灵活。在过去十年中，mrna修饰和递送系统领域的技术发展迅速推进了mrna疫苗的基础和临床研究。然而，mrna疗法面临的技术问题也很明显，比如mrna在体内表达效率低等问题，mrna疫苗的保护效力并不乐观，这些也是临床应用亟需优化的关键问题。

2、基于稳定性和蛋白翻译效率而优化开发的mrna，可以最大限度地提高mrna生产及避免递送中的损失问题。5'utr在mrna翻译过程中至关重要，包括核糖体募集，扫描和起始密码子选择。5'utr序列长度一般在100-200核苷酸。carsten rudolph等在一项研究中比较了5个不同的utr序列对于mrna稳定性和翻译效率的影响，结果显示人细胞cyba utr序列可以在不影响rna半衰期的情况下增强翻译效率。有研究发现双拷贝beta globin 3'utr序列在树突细胞中支持蛋白的高效表达。在过往研究中使用到的utr序列包括：来自cmv（cytomegalovirus，人类巨噬细胞病毒)的增强子序列，人α-珠蛋白（alpha-globin）5'utr、人生长激素utr序列、非洲爪蟾蜍β-珠蛋白（beta-globin）utr等。utr对于mrna翻译效率的影响不仅与细胞类型有关，而且高度依赖二级结构。相对较短的设计utr能更好的完成预设目的，设计出最短的utr序列是非常有必要的，既可以免受细胞类型差异的影响，又能够在插入修饰核苷酸时使其对翻译效率的影响降至最弱。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供能够提高蛋白编码区翻译效率的5`-utr序列及其在制备mrna药物中的应用。

2、本发明的第一方面,提供了一种5`utr元件，所述5`utr元件用于构建mrna转录模板，提高所述mrna转录模板转录得到的mrna中编码区的翻译效率，所述5`-utr元件的核苷酸序列如seq id no: 1所示。

3、在另一优选例中，所述5`utr元件的核苷酸序列还包括：

4、与seq id no: 1所示序列的同源性≥70%(较佳地≥80%，更佳地≥90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%)，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列；或

5、如seq id no: 1所示核苷酸序列的5`端和/或3`端增加和/或减少1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。

6、在另一优选例中，所述5`utr元件的长度为40-120nt，较佳地50-100nt。

7、本发明的第二方面,提供了一种mrna转录模板构建体，所述构建体具有式i结构：

8、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7                (i)

9、式中，

10、z1、z7为无或酶切位点；

11、z2为无或启动子元件或内部核糖体进入位点序列（ires）；

12、z3为本发明第一方面所述的5`utr元件；

13、z4为可替换的编码区；

14、z5为3`utr元件；

15、z6为无或polya尾部元件。

16、在另一优选例中，所述z1、z7为平末端酶切位点或粘性末端酶切位点。

17、在另一优选例中，所述mrna转录模板构建体包括酶切位点、启动子元件、5`utr元件、可替换的编码区和3`utr。

18、在另一优选例中，所述z2为启动子元件，所述启动子选自下组：t7启动子、t3启动子、sp6启动子、cag启动子、ubc启动子、cmv启动子、u6启动子、ef1a启动子、pgk1启动子、tre启动子、ac5启动子、uas启动子、sv40启动子、adh1启动子、camv35s启动子、ubi启动子、lac启动子、ptac启动子、pl启动子，或其组合。

19、在另一优选例中，所述z3具有如seq id no: 1所示的核苷酸序列。

20、在另一优选例中，所述z4为用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的蛋白编码基因。

21、在另一优选例中，所述z4选自下组：病原体抗原基因、基因组中的转座子（包括沉默和活跃转座子）、细胞因子、生长因子、蛋白激素、多肽激素、肿瘤相关抗原（taa）、肿瘤特异性抗原（tsa）、通用肿瘤突变位点抗原、蛋白佐剂、多肽佐剂、核酸佐剂，或其组合。

22、在另一优选例中，所述z5与z3来源于同一转录本。

23、在另一优选例中，所述z5与z3来源于不同转录本。

24、在另一优选例中，所述z5的核苷酸序列如seq id no: 5所示。

25、本发明的第三方面,提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的mrna转录模板构建体。

26、在另一优选例中，所述载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合；优选地，所述载体为质粒。

27、本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体。

28、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

29、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

30、本发明的第五方面,提供了一种产生用于制备mrna药物的优化mrna的方法，所述方法包括步骤：

31、(i) 在适合的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含有mrna转录模板构建体的载体的培养物；

32、(ii) 从所述培养物中分离和/或回收(i)中所述载体，并酶切线性化为mrna转录模板；和

33、(iii) 将(ii)中所述mrna转录模板进行转录，从而获得所述优化mrna。

34、在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)：对步骤(iii)获得的优化mrna进行纯化和/或修饰。

35、本发明的第六方面,提供了一种优化mrna，所述优化mrna是用如本发明第五方面所述的方法制备得到的，并且所述优化mrna具有式ii所示结构：

36、m1-m2-m3-m4-m5-m6                (ii)

37、式中，

38、m1为5`端帽子元件；

39、m2为无或内部核糖体进入位点序列（ires）；

40、m3为本发明第一方面所述的5`utr元件；

41、m4为可替换的编码区；

42、m5为3`utr元件；

43、m6为polya尾部元件。

44、在另一优选例中，所述m3具有如seq id no: 1所示的核苷酸序列。

45、在另一优选例中，所述m4为用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的蛋白编码基因。

46、在另一优选例中，所述m4选自下组：病原体抗原基因、基因组中的转座子（包括沉默和活跃转座子）、细胞因子、生长因子、蛋白激素、多肽激素、肿瘤相关抗原（taa）、肿瘤特异性抗原（tsa）、通用肿瘤突变位点抗原、蛋白佐剂、多肽佐剂、核酸佐剂，或其组合。

47、在另一优选例中，所述m5与m3来源于同一转录本。

48、在另一优选例中，所述m5与m3来源于不同转录本。

49、在另一优选例中，所述m5具有如seq id no: 5所示的核苷酸序列。

50、在另一优选例中，所述m6的长度较佳地为100 nt-150 nt，更佳地为110 nt-130nt，最佳地为120 nt。

51、在另一优选例中，所述m6的序列如seq id no: 6所示。

52、本发明的第七方面,提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

53、(c1) 如本发明第二方面所述的mrna转录模板构建体，或如本发明第六方面所述的优化mrna作为活性成分；和

54、(c2) 药学上可接受的载体。

55、在另一优选例中，所述药物组合物为疫苗组合物。

56、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂、雾化吸入剂、涂抹式药剂。

57、在另一优选例中，所述药物组合物通过注射施用，即静脉内、肌内、皮内、皮下、鞘内、十二指肠内或腹膜内注射。

58、在另一优选例中，所述药物组合物通过吸入施用，例如鼻内施用。

59、在另一优选例中，所述药物组合物经皮施用，例如经皮涂抹施用或电极导入给药。

60、在另一优选例中，所述药物组合物是将所述mrna用阳离子脂进行包裹所形成的脂质纳米颗粒，即lnp-mrna。

61、在另一优选例中，所述疫苗组合物包括0.01～99.99%的如本发明第六方面所述的优化mrna和0.01～99.99%的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗组合物的质量百分比。

62、在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗包括（但不限于）传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的药物。

63、本发明的第八方面,提供了一种mrna药物组合物的制备方法，所述方法包括：将如本发明第六方面所述的优化mrna与药学上可接受的载体混合，从而获得所述mrna药物组合物。

64、在另一优选例中，所述mrna药物组合物为mrna疫苗组合物。

65、本发明的第九方面,提供了一种如本发明第一方面所述的5`utr元件的用途，用于构建mrna转录模板，从而提高所述mrna转录模板转录得到的mrna中编码区的翻译效率。

66、本发明的第十方面,提供了一种如本发明第六方面所述的优化mrna或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤。

67、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。