一种大肠杆菌发酵生产胞苷的方法与流程

本发明属于发酵过程优化，涉及一种大肠杆菌发酵生产胞苷的方法。

背景技术：

1、胞苷又名胞嘧啶核苷、胞啶、1-β-d-呋喃核苷胞嘧啶。胞苷作为嘧啶核苷主要用于生产抗肿瘤、抗病毒药物的中间体，是制造阿糖胞苷(ara-cr)、环胞苷(cycloc)、三磷酸胞苷(ctp)、胞二磷胆碱(cdp-choline)等药物的主要原料。目前胞苷的生产方法有rna水解法、发酵法和合成法相结合、以尿嘧啶为前体的发酵法、直接发酵法等。随着对抗病毒、抗肿瘤、治疗艾滋病药物研究的深入，对天然胞苷的需求量也日益增加，人们期望得到廉价的、能大规模生产胞苷的工艺方法。

2、国外在20世纪90年代中期才有关于胞苷可以经发酵法大规模生产的报道，而我国有关发酵法生产胞苷的研究尚属空白。随着对胞苷需求量的不断增加，发酵法生产胞苷的研究也日益得到更广泛的重视。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种大肠杆菌发酵法生产胞苷的方法。本发明所提供的大肠杆菌发酵法生产胞苷的方法，工艺简单、收率高，适合工业化。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种大肠杆菌发酵生产胞苷的方法，所述的方法为大肠杆菌种子液接种至发酵罐中进行发酵培养；所述的发酵培养在发酵培养基中添加胞苷前体物质；所述的发酵培养在发酵过程中添加诱导剂。

3、其中，所述的大肠杆菌为具有胞苷生产能力的大肠杆菌，优选地，在本发明的实施例中，所述的大肠杆菌，其出发菌株为大肠杆菌w3110(atcc27325)，其具体的构建方法及过程参考中国专利[cn2017100038337]所述的方法制备得到的重组大肠杆菌。

4、其中，所述的胞苷前体物质为谷氨酸、谷氨酰胺、乳清酸和天冬氨酸中的任意一种或几种的组合。优选为乳清酸或天冬氨酸中的任意一种或几种的组合。最优选为天冬氨酸。

5、其中，所述的诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)。

6、其中，所述的诱导剂分2次添加。

7、其中，当发酵液od660为12-20时，第一次加入诱导剂；当发酵液od660为45-60时，第二次加入诱导剂。优选地，当发酵od660为15时，第一次加入诱导剂；当发酵od660为50时，第二次加入诱导剂。

8、其中，每升发酵培养基中，诱导剂的添加总量为0.02-0.12g。优选地，每升发酵培养基中，诱导剂的添加总量0.04-0.08g。最优选地，每升发酵培养基中，诱导剂的添加总量为0.05-0.06g。

9、其中，当诱导剂分多次添加时，每次添加量相同。

10、其中，所述的大肠杆菌种子液为经摇瓶培养大肠杆菌接种至种子培养基中培养所得。

11、其中，所述的摇瓶培养基配方为蛋白胨5-15g/l，酵母浸粉2-10g/l，氯化钠5-15g/l，甘油1-5g/l，培养温度为30-40℃，转速为100-300rpm，培养10-18h，得到的摇瓶菌液以10％v/v接种量接种至种子培养基中；优选地，摇瓶培养基配方为蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，甘油2g/l，培养温度为36℃，转速为200rpm，培养12h。

12、所述的种子培养基配方为蛋白胨5-15g/l，酵母浸粉2-10g/l，氯化钠5-15g/l，甘油1-5g/l，消泡剂0.01-0.5g/l，培养温度为30-40℃，转速为200-300rpm，培养至od660为4-6得到种子液，种子液以10％v/v的接种量接种至发酵培养基中。优选地，种子培养基配方为蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，甘油2g/l，消泡剂0.1g/l，培养温度为36℃，转速为200rpm，培养至od660为5得到种子液。

13、其中，所述的发酵培养，发酵培养基配方为：酵母浸粉10-20g/l，葡萄糖30-50g/l，硫酸铵5-15g/l，磷酸二氢钾3-6g/l，硫酸镁1-5g/l，氯化钙0.1-0.5g/l，氯化锌0.01-0.05g/l，硫酸锰0.0001-0.0005g/l，柠檬酸铁0.1-0.5g/l，消泡剂0.1-0.5g/l，胞苷前体物质2-10g/l；发酵温度为30-40℃，发酵时间为40-50h，发酵过程中调整转速与通气量使溶氧水平do保持在25％±5％，当溶氧快速反弹(溶氧30秒内反弹40％以上)时向发酵罐中补加葡萄糖浓度为50％(w/w)的葡萄糖溶液，补糖速度为15g/l/h，直至发酵结束。优选地，发酵培养基配方为：酵母浸粉15g/l，葡萄糖40g/l，硫酸铵10g/l，磷酸二氢钾4g/l，硫酸镁2g/l，氯化钙0.2g/l，氯化锌0.02g/l，硫酸锰0.0002g/l，柠檬酸铁0.3g/l，消泡剂0.2g/l，胞苷前体物质5g/l；发酵温度为36℃，发酵时间为48h，发酵过程中调整转速(≤500rpm)与通气量使溶氧水平do保持在25％±5％，当溶氧快速反弹(溶氧30秒内反弹40％以上)时向发酵罐中补加葡萄糖浓度为50％(w/w)的葡萄糖溶液，补糖速度为15g/l/h，直至发酵结束。

14、有益效果：

15、1、本发明的发酵培养基中添加了胞苷的前体物质，更有益于产物胞苷的积累。

16、2、通过两次诱导策略，使胞苷合成过程中的关键酶(如prpp合成酶)得到充分的表达。

17、3、本发明所提供的发酵法生产胞苷的技术，工艺简单、收率高，适合工业化。

技术特征：

1.一种大肠杆菌发酵生产胞苷的方法，将大肠杆菌种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，其特征在于，所述的发酵培养基包含胞苷前体物质；所述的发酵培养在发酵过程中添加诱导剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为具有胞苷生产能力的大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胞苷前体物质为谷氨酸、谷氨酰胺、乳清酸和天冬氨酸中的任意一种或几种的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诱导剂分2次添加。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当发酵液od660为12-20时，第一次加入诱导剂；当发酵液od660为45-60时，第二次加入诱导剂。

7.根据权利要求1或4或5或6所述的方法，其特征在于，每升发酵培养基中，诱导剂的添加总量为0.02-0.12g。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌种子液为经摇瓶培养的大肠杆菌接种至种子培养基中培养所得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的摇瓶培养基配方为蛋白胨5-15g/l，酵母浸粉2-10g/l，氯化钠5-15g/l，甘油1-5g/l，培养温度为30-40℃，转速为100-300rpm，培养10-18h，得到的摇瓶菌液以10％v/v接种量接种至种子培养基中；

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养，发酵培养基配方为：酵母浸粉10-20g/l，葡萄糖30-50g/l，硫酸铵5-15g/l，磷酸二氢钾3-6g/l，硫酸镁1-5g/l，氯化钙0.1-0.5g/l，氯化锌0.01-0.05g/l，硫酸锰0.0001-0.0005g/l，柠檬酸铁0.1-0.5g/l，消泡剂0.1-0.5g/l，胞苷前体物质2-10g/l；发酵温度为30-40℃，发酵时间为40-50h，发酵过程中调整转速与通气量使溶氧水平do保持在25％±5％，当溶氧30秒内反弹40％以上时，向发酵罐中补加葡萄糖浓度为50％(w/w)的葡萄糖溶液，补糖速度为15g/l/h，直至发酵结束。

技术总结
本发明公开了一种大肠杆菌发酵生产胞苷的方法，属于发酵过程优化技术领域。以大肠杆菌为生产菌株，以葡萄糖为碳源，在一定的发酵条件下进行胞苷的发酵生产。发酵过程中通过添加前体物质及两次诱导策略，胞苷最终产量达到82.3g/L。本发明所提供的发酵法生产胞苷的技术，工艺简单、收率高，适合工业化。

技术研发人员：陈晓春,黄小权,张磊,汤亦文,汤春霞
受保护的技术使用者：南京同凯兆业生物技术有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17