一种微生物发酵制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法与流程

本发明涉及生物发酵工程，具体涉及一种微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技术：

1、n-乙酰氨基葡萄糖（glcnac），化学名称为1-乙酰氨基-2-脱氧葡萄糖，化学式为c8h15no6，是一种被广泛应用的重要多功能单糖。n-乙酰氨基葡萄糖作为自然界第二大天然多糖几丁质的基本组成单位，具有还原性，不仅是合成双歧因子的重要前提，还在生物体内作为多糖透明质酸、肝素和硫酸角质素的重要组成部分之一，维持着生物体正常的生理功能，在生物体正常生长代谢过程中起重要作用，在医药保健、食品和化妆品等领域都具有广阔的应用。

2、目前，制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法主要由化学法、微生物发酵法和酶解法。其中，化学法是直接在高温条件下使用浓盐酸或硫酸水解几丁质，经纯化得到n-乙酰氨基葡萄糖，但化学法生产效率低，存在安全隐患，且还需要对酸液进行处理。酶解法则是通过一种或多种酶协同催化几丁质生产n-乙酰氨基葡萄糖，但目前酶工程的常用方法为：将微生物中能够水解几丁质的没基因异源表达至大肠杆菌表达系统以解决野生酶分离纯化困难、表达量低和酶活不高的问题。而微生物发酵法则是采用微生物菌剂进行发酵生产n-乙酰氨基葡萄糖，微生物发酵法具有生产效率高、污染小等优点。

3、但现有技术中多通过对微生物进行基因改造，构建高效生产n-乙酰氨基葡萄糖的工程菌，以提高微生物的n-乙酰氨基葡萄糖产量。目前，多采用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或谷氨酸棒状杆菌作为基础，构建基因工程菌用于发酵生产n-乙酰氨基葡萄糖，但基因工程的使用和研究往往需要大量的资金和时间支撑，且不利于工业大规模普及和应用，同时，诱变或转基因处理作为一种新兴的生物技术手段，具有不成熟和不确定性，从而使得制得的产品伴随着生物安全性的问题。

4、现有技术中，cn110724722a公开了一种微生物发酵生产n-乙酰氨基葡萄糖的方法，采用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母组成的混合发酵菌剂，实现了增加n-乙酰氨基葡萄糖产量，但其发酵速率慢，发酵周期较长。论文《代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖基过程优化与控制》（江南大学 陈欣）中提到：当采用大肠杆菌作为发酵菌株时，在发酵过程中，细胞会将制得的n-乙酰氨基葡萄糖从胞外转入胞内作为碳源使用，降低了胞外n-乙酰氨基葡萄糖的浓度，从而降低n-乙酰氨基葡萄糖的产量。由此可见，在发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的过程中，随着发酵时间的延长，n-乙酰氨基葡萄糖的产量并不是一直呈现增长的趋势，相反，当反应进行一定程度时，n-乙酰氨基葡萄糖的产量呈现下降的趋势。

5、因此，选择合适的菌株进行组合并用于发酵生产n-乙酰氨基葡萄糖，避免制得的n-乙酰氨基葡萄糖由胞外转移至胞内，从而提高n-乙酰氨基葡萄糖的产量、缩短其发酵周期，是微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法。本发明将大肠埃希氏菌种子液、阿萨希丝孢酵母种子液和恶臭假单胞菌种子液混合后，接种至发酵培养基中进行发酵，即得含有n-乙酰氨基葡萄糖的发酵液。本发明采用大肠埃希氏菌、阿萨希丝孢酵母和恶臭假单胞菌组合作为发酵菌剂用于制备n-乙酰氨基葡萄糖，一方面，可抑制在发酵过程中生成的n-乙酰氨基葡萄糖由胞外转移至胞内，从而保证n-乙酰氨基葡萄糖的产量，另一方面，利用这三株菌的酶系组成和生理生化特点，可明显缩短n-乙酰氨基葡萄糖的发酵时间。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：

4、将大肠埃希氏菌种子液、阿萨希丝孢酵母种子液和恶臭假单胞菌种子液混合后，得混合种子液；将混合种子液接种至发酵培养基中，进行发酵，得n-乙酰氨基葡萄糖。

5、优选的，所述发酵培养基包括如下组分：15-25g/l葡萄糖、2-5g/l酵母粉、6-7g/lkh2po4、3-5g/l (nh4)2so4、3-4g/l柠檬酸、1.5-2.5g/l谷氨酸、2-3g/l mgso4·7h2o、8-12mg/l feso4、20-30mg/l cacl2·2h2o、1-1.5mg/l mnso4、0.5-1.5g/l nacl、0.2-0.3ml/l消泡剂、0.2-0.6mg/l维生素b1和0.05-0.15mg/l 维生素h，ph7.0-7.2。

6、优选的，大肠埃希氏菌的菌株编号为cicc 10899；阿萨希丝孢酵母的菌株编号为cicc 33135；恶臭假单胞菌的保藏编号为accc 19852。

7、优选的，混合种子液中，大肠埃希氏菌种子液、阿萨希丝孢酵母种子液和恶臭假单胞菌种子液的体积比为10：（4-6）：（3-5）。

8、优选的，发酵条件为：溶解氧26-28%、温度35-38℃，发酵时间为26-30h。

9、优选的，混合种子液的接种量为发酵培养基体积的10-15%。

10、优选的，混合种子液中，大肠埃希氏菌的活菌数≥3.5×108cfu/ml，阿萨希丝孢酵母的活菌数≥1.8×108cfu/ml，恶臭假单胞菌的活菌数≥1.2×108cfu/ml。

11、本发明的有益效果：

12、本发明采用大肠埃希氏菌、阿萨希丝孢酵母和恶臭假单胞菌共同用于发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖，这三个菌株对营养物的需求相应，且各个菌株之间无拮抗作用。同时，本发明将这三个发酵菌种复配使用用于n-乙酰氨基葡萄糖的发酵，一方面，可抑制在发酵过程中生成的n-乙酰氨基葡萄糖由胞外转移至胞内，从而保证n-乙酰氨基葡萄糖的产量，另一方面，利用这三株菌的酶系组成和生理生化特点，可明显缩短n-乙酰氨基葡萄糖的发酵时间。

技术特征：

1.一种微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，大肠埃希氏菌的菌株编号为cicc 10899；阿萨希丝孢酵母的菌株编号为cicc 33135；恶臭假单胞菌的保藏编号为accc 19852。

3.如权利要求1所述的微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，混合种子液中，大肠埃希氏菌种子液、阿萨希丝孢酵母种子液和恶臭假单胞菌种子液的体积比为10：（4-6）：（3-5）。

4.如权利要求1所述的微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，混合种子液中，大肠埃希氏菌的活菌数≥3.5×108cfu/ml，阿萨希丝孢酵母的活菌数≥1.8×108cfu/ml，恶臭假单胞菌的活菌数≥1.2×108cfu/ml。

5.如权利要求1所述的微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，混合种子液的接种量为发酵培养基体积的10-15%。

6.如权利要求1所述的微生物发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，发酵条件为：溶解氧26-28%、温度35-38℃，发酵时间为26-30h。

技术总结
本发明公开了一种微生物发酵制备N‑乙酰氨基葡萄糖的方法，涉及生物发酵工程技术领域。本发明将大肠埃希氏菌种子液、阿萨希丝孢酵母种子液和恶臭假单胞菌种子液混合后，接种至发酵培养基中进行发酵，即得含有N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵液。本发明采用大肠埃希氏菌、阿萨希丝孢酵母和恶臭假单胞菌组合作为发酵菌剂用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖，利用这三株菌的酶系组成和生理生化特点，可明显缩短N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵时间，还能抑制N‑乙酰氨基葡萄糖由胞外转移至胞内作为碳源被损耗，从而提高其产量。

技术研发人员：卢健行,张倩,徐艳,朱秀苗,潘庆晓,庄震宇,庄艳慧,王进
受保护的技术使用者：山东润德生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5