检测戊型肝炎病毒的引物对、试剂盒及方法

本公开属于生物核酸分子检测，具体涉及一种检测戊型肝炎病毒的引物对、探针和试剂盒。

背景技术：

1、戊型肝炎病毒(hepatitis e virus，hev)是全球急性病毒性肝炎最常见的原因之一，hev感染使全球公共卫生安全受到了威胁和挑战。戊型肝炎病毒是目前已知的五种肝炎病毒之一，病毒类学研究将其划归为戊型肝炎病毒科，其又可分为两个属，即正戊型肝炎病毒属(orthohepevirus)和鱼戊型肝炎病毒属(piscihepevirus)。目前研究较多的哺乳动物和禽类hev均属于正戊型肝炎病毒属，其主要分为a-d 4个种。正戊肝病毒属a物种包含至少8个基因型。到目前为止，已经在家养和野生猪群中发现了四种基因型的hev：hev3和hev4是人畜共患病原，可以感染人类和非灵长类动物。而hev5和hev6仅在野猪中发现。hev3主要流行于欧洲、亚洲和美洲，hev4主要发现于欧洲和亚洲，我国主要流行的是hev4。

2、hev3和hev4作为人畜共患病原，在全国范围内广泛流行。可感染猪、鹿、牛、羊、猴等多种动物。例如，人食用生的或未熟的猪肉是食源性hev从猪向人传播的重要途径。hev在猪群中可以通过排泄物以及被其污染的饲料和饮水传播，其中粪口途径是猪hev的主要传播途径。hev在我国猪群中呈普遍流行的趋势，因此，需要直接接触猪、猪粪或污水的养猪场和屠宰场的从业人员感染人兽共患型hev的风险会相对较高。

3、在健康人群中，大部分感染者表现为急性自限性肝炎，可自愈或仅出现消化道症状；但在输注污染的血液制品或接受器官移植的免疫力低下的人群或有基础肝病的老年人中，急性感染可能导致严重的暴发性肝炎(急性肝衰竭)，或发展为慢性肝炎，甚至出现肝硬化。一些患者还会出现肝外表现，包括神经系统、血液系统和肾脏疾病。因此，快速可靠地诊断和监测hev将有助于保障动物源性食品安全和公共卫生。

4、目前，国内外已经建立了多种直接或间接检测hev的免疫学和分子生物学方法，如免疫电镜(iem)、间接免疫荧光(ifa)、免疫印迹(ib)、免疫组化(ihc)、免疫层析(ica)、酶联免疫吸附实验(elisa)等、反转录-巢式pcr(rt-npcr)、荧光定量rt-pcr(qrt-pcr)和环介导等温扩增等(lamp)。这些方法虽然准确可靠，但存在以下缺点，如检测时间长，操作复杂，成本较高，对配套的反应仪器有严格要求，需要训练有素的专业人员，这阻碍了该技术在设备不足的基础实验室或资源有限的环境中应用。

5、因此，开发操作简单、便携且可视化、灵敏度高、特异性强的现场检测hev的方法，对于预防和控制该疾病至关重要。

技术实现思路

1、为了解决上述至少一个技术问题，本公开提供了一种检测戊型肝炎病毒的引物对、探针和试剂盒。

2、根据本公开的第一方面，提供了一种检测戊型肝炎病毒的引物对，包括上游引物和下游引物，

3、所述上游引物包括如seq id no:1、3～7任一项所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；

4、所述下游引物包括如seq id no:8～11所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。

5、在一些实施方式中，所述上游引物包括如seq id no:6或7所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；

6、所述下游引物包括如seq id no:10所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。

7、在一些实施方式中，所述上游引物包括如seq id no:15～34或53所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；

8、所述下游引物包括如seq id no:35～50或54所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。

9、在一些实施方式中，所述上游引物包括如seq id no:15～34或53所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；

10、所述下游引物包括如seq id no:35～40、42～46、49或54所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。

11、在一些实施方式中，所述上游引物和/或所述下游引物包含简并碱基。

12、在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括c或t。

13、在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括a或g。

14、在一些实施方式中，所述上游引物和/或所述下游引物的至少一个核苷酸残基上连接有生物素。

15、在一些实施方式中，所述上游引物和/或所述下游引物的5'末端和/或3'末端的核苷酸残基上连接有生物素。

16、在一些实施方式中，所述下游引物包括如seq id no:55所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。

17、根据本公开的第二方面，提供了一种检测戊型肝炎病毒的试剂盒，包括第一方面所述的引物对。

18、在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括探针，所述探针包括如seq id no:51(ttgtctcrgccaatggcgagccgacwgtgaaactttacacatcagt)或seq id no:52(tgttttactcycgccccgttgtctcrgccaatggcgagccgacagt)所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。

19、在一些实施方式中，所述探针包含简并碱基。

20、在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括a或g。

21、在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括a或t。

22、在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括c或t。

23、在其中一些具体的实施方式中，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有荧光基团，3'末端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的阻断基团，所述探针在所述荧光基团和阻断基团之间插入四氢呋喃。

24、在一些更具体的实施方式中，所述探针在5'末端连接有荧光基团。

25、在一些更具体的实施方式中，所述探针在距5'末端至少30个核苷酸残基的位置的碱基替换为四氢呋喃。

26、在一些更具体的实施方式中，所述荧光基团包括fam、tet、joe、hex、tamra、rox、texas red、lc red640、lc red705、5-iaf、6-tet、bis、荧光素-5-马来酰亚胺、5-fitc、磺胺罗丹明g、荧光素及其盐、6-fam、6-tritc、5-tamra、6-tamra、6-cr6g、5-fitc、5-fam、6-fam、罗丹明b、罗丹明6g、amc、cy3或cy5中的任意一种。

27、在一些更具体的实施方式中，所述阻断基团包括羟甲基叠氮、c18、c12、ddntp、rna、pna、磷酸基团或c3-spacer中任意一种。

28、在一些更具体的实施方式中，所述探针的至少一个胸腺嘧啶核苷酸残基上连接有荧光基团。

29、在一些更具体的实施方式中，所述探针包括如seq id no:57所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。

30、在一些更具体的实施方式中，所述试剂盒还包括侧向流动检测试纸条，所述侧向流动检测试纸条包括加样垫、质控c线和检测t线。

31、在另外一些具体的实施方式中，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有荧光基团，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有淬灭基团，3'末端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的阻断基团，所述探针在所述荧光基团和所述淬灭基团之间插入四氢呋喃。

32、在一些更具体的实施方式中，所述探针的至少一个胸腺嘧啶核苷酸残基上连接有荧光基团。

33、在一些更具体的实施方式中，所述探针的至少一个胸腺嘧啶核苷酸残基上连接有淬灭基团。

34、在一些更具体的实施方式中，所述探针上连接有荧光基团的核苷酸残基和连接有淬灭基团的核苷酸残基之间相隔1～30个核苷酸残基。

35、在一些更具体的实施方式中，所述探针上连接有荧光基团的核苷酸残基和连接有淬灭基团的核苷酸残基之间相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸残基。

36、在一些更具体的实施方式中，所述探针在距5'末端至少30个核苷酸残基的位置的碱基替换为四氢呋喃。

37、在一些更具体的实施方式中，所述探针在距5'末端至少30个核苷酸残基的位置的碱基替换为四氢呋喃。

38、在一些更具体的实施方式中，所述荧光基团包括fam、tet、joe、hex、tamra、rox、texas red、lc red640、lc red705、5-iaf、6-tet、bis、荧光素-5-马来酰亚胺、5-fitc、磺胺罗丹明g、荧光素及其盐、6-fam、6-tritc、5-tamra、6-tamra、6-cr6g、5-fitc、5-fam、6-fam、罗丹明b、罗丹明6g、amc、cy3或cy5中的任意一种。

39、在一些更具体的实施方式中，所述淬灭基团包括：bhq、edans、mgb、dabcyl。

40、在一些更具体的实施方式中，所述淬灭基团包括bhq或bhq-1。

41、在一些更具体的实施方式中，所述阻断基团包括羟甲基叠氮、c18、c12、ddntp、rna、pna、磷酸基团或c3-spacer中任意一种。

42、在一些更具体的实施方式中，所述探针包括如seq id no:56所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。

43、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括逆转录酶、重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、dntp、dna损伤修复活性的酶。

44、在一些实施方式中，dna损伤修复活性的酶包括核酸内切酶或核酸外切酶。

45、在一些实施方式中，所述核酸内切酶包括核酸内切酶iii或核酸内切酶iv。

46、在一些实施方式中，所述核酸内切酶包括核酸内切酶iv。

47、在一些实施方式中，所述核酸外切酶包括3'-5'核酸外切酶。

48、在一些实施方式中，所述3'-5'核酸外切酶包括核酸外切酶exoiii。

49、在一些实施方式中，所述试剂盒包括质控品；

50、在一些实施方式中，所述质控品包括阳性质控品或阴性质控品；

51、在一些实施方式中，所述阳性质控品含有戊型肝炎病毒的核酸，所述阴性质控品不含有戊型肝炎病毒的核酸。

52、根据本公开的第三方面，提供了一种使用第一方面所述引物或第二方面所述试剂盒检测戊型肝炎病毒的方法。

53、在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：

54、1)提取待测样本的总rna；

55、2)以所述总rna为模版进行逆转录，得到cdna产物，并使用所述试剂盒对cdna产物进行重组酶辅助等温扩增反应，并使用所述试剂盒进行重组酶辅助等温扩增反应，得到扩增产物；

56、3)使用测流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果；

57、判断方法包括：质控c线和检测t线均出现条带，则实验有效，判定样品中含有戊型肝炎病毒；质控c线出现条带，而检测t线不出现条带，则实验有效，判定样品中不含有戊型肝炎病毒；质控c线不出现条带，则实验无效。

58、在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.2～0.5μm。

59、在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括但不限于0.2μm、0.3μm、0.4μm或0.5μm。

60、在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.4μm。

61、在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括0.1～0.3μm。

62、在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括但不限于0.1μm、0.11μm、0.12μm、0.13μm、0.14μm、0.15μm、0.16μm、0.17μm、0.18μm、0.19μm、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm或0.3μm。

63、在一些实施方式中，每条探针的工作浓度为0.12μm。

64、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括30～42℃。

65、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括5～30分钟。

66、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括但不限于30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。

67、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括但不限于5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟。

68、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的条件包括在39℃下恒温扩增15分钟。

69、在一些实施方式中，所述待测样本包括天然样本或标准品。

70、在一些实施方式中，所述待测样本包括组织样本或体液样本。

71、在一些实施方式中，所述体液样本包括：唾液、全血液、血清、血浆、粪便和它们的处理物；和/或，

72、所述组织样本包括肝脏组织、石蜡切片和它们的处理物。

73、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒属于正戊肝病毒属a物种。

74、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括hev3和/或hev4基因型。

75、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。

76、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。

77、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于猪。

78、根据本公开的第四方面，提供了一种使用第一方面所述引物或第二方面所述试剂盒检测戊型肝炎病毒的的方法，包括如下步骤：

79、1)提取待测样本的总rna；

80、2)以所述总rna为模版进行逆转录，得到cdna产物，并使用所述试剂盒对cdna产物进行重组酶辅助扩增反应；

81、3)扩增反应同时收集信号，判断检测结果；

82、判断方法包括：若信号能够形成扩增曲线，或蓝光检测仪检测到信号，则判定样品中含有戊型肝炎病毒。

83、在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.2～0.5μm。

84、在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括但不限于0.2μm、0.3μm、0.4μm或0.5μm。

85、在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.4μm。

86、在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括0.1～0.3μm。

87、在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括但不限于0.1μm、0.11μm、0.12μm、0.13μm、0.14μm、0.15μm、0.16μm、0.17μm、0.18μm、0.19μm、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm或0.3μm。

88、在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括0.12μm。

89、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括30～42℃。

90、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括5～30分钟。

91、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括但不限于30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。

92、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括但不限于5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟。

93、在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的条件包括在42℃下恒温扩增20分钟。

94、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒属于正戊肝病毒属a物种。

95、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括hev3和/或hev4基因型。

96、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。

97、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。

98、根据本公开的第五方面，提供了第一方面所述引物对在制备检测待测样本中戊型肝炎病毒的试剂盒中的应用。

99、在一些实施方式中，所述待测样本包括天然样本或标准品。

100、在一些实施方式中，所述待测样本包括组织样本或体液样本。

101、在一些实施方式中，所述体液样本包括：唾液、血液、血清、血浆、粪便和它们的处理物；和/或，

102、所述组织样本包括组织及其处理物。

103、在一些实施方式中，所述组织样本包括肝组织样本。

104、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括正戊肝病毒属a物种。

105、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括hev3和/或hev4基因型。

106、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。

107、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。

108、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于猪。

109、根据本公开的第六方面，提供了第一方面所述引物对、第二方面所述试剂盒、第三方面或第四方面所述方法在检测待测样本中戊型肝炎病毒中的应用。

110、在一些实施方式中，所述待测样本包括天然样本或标准品。

111、在一些实施方式中，所述待测样本包括组织样本或体液样本。

112、在一些实施方式中，所述体液样本包括：唾液、血液、血清、血浆、粪便和它们的处理物；和/或，

113、所述组织样本包括组织及其处理物。

114、在一些实施方式中，所述组织样本包括肝组织样本。在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括正戊肝病毒属a物种。

115、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括hev3和/或hev4基因型。

116、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。

117、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。

118、在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于猪。

119、本公开的有益效果在于：

120、本公开所述检测戊型肝炎病毒的引物对、探针和试剂盒，能够针对戊型肝炎病毒进行基于重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流动检测试纸条的rt-raa-lfd或基于重组酶聚合酶扩增技术结合实时荧光定量的qrt-raa两种方式的检测，适宜于现场快速可视化检测hev orf2基因，可实现对戊型肝炎病毒进行快速、高特异性、高灵敏性、更加简便的检测，从而克服现有检测技术中检测时间长，操作复杂，成本较高等缺陷。实现了戊型肝炎病毒的现场快速可视化检测。

121、基于本公开提供的引物和探针进行戊型肝炎病毒的扩增，只需在恒温条件下短时间反应即可完成，该方法反应快速，对仪器要求简单，仅需恒温装置即可完成核酸扩增过程，例如恒温水浴锅或便携式恒温仪，借助侧向流试纸条可以对检测结果进行肉眼判读，无需要依赖贵重的凝胶成像系统和电脑等设备，繁杂的实验步骤，对操作人员要求不高，降低了经济成本、人力成本和时间成本，尤其适用于基层现场诊断、即时检测和微量检测，在兽医临床具有广泛的应用前景，也为保障动物源性食品安全提供技术支撑。