一种从鼻黏膜组织提取神经干细胞的试剂盒及提取方法与流程

本发明属于细胞诱导及培养，具体涉及一种从鼻黏膜组织提取神经干细胞的试剂盒及提取方法。

背景技术：

1、神经干细胞(neural stem cell，nsc)是一群能自我更新并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能的细胞。神经干细胞位于大脑的特定的部位中，包括脑室下区(svz)、颗粒下区(sgz)及海马的齿状回。

2、nsc有多种来源，如人类胚胎干细胞、人胎脑源性神经干/祖细胞、人类诱导多能干细胞、直接重编程星形胶质细胞等。这些部位的nsc具有增殖、迁移并分化为神经元和神经胶质细胞的能力，能够在损伤的情况下激活、迁移来参与损伤的修复。许多颅脑、脊髓损伤以及神经退行性疾病的研究发现内源性nsc可以对疾病有一定的修复能力。由于神经干细胞数量较少，多处于静止状态且疾病导致的微环境等多种影响下，内源性nsc的修复效果有限。因此，补充外源性神经干细胞作为目前研究神经干细胞修复的主要方法。

3、目前外源性nsc的主要来源为胚胎干细胞诱导、诱导多能干细胞诱导以及成体组织分离而来。这些方法所获得的nsc数量少，纯度不高，并且存在安全性和伦理学问题，限制了神经干细胞的临床应用前景；目前体外诱导nsc的大多数方法为化学药物、物理环境及细胞因子的诱导方法，但是这些方法大部分诱导时间长，细胞存活率低，不利于外源性神经干细胞的临床应用。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明的目的在于提供一种从鼻黏膜组织获取神经干细胞的试剂盒及提取方法，采用一种以细胞生长因子为主的诱导方式，分阶段从鼻黏膜组织提取神经干细胞，弥补现有诱导方案存在的伦理问题、培养时间过长及纯度不高的技术缺陷。

2、本发明提供了一种从鼻黏膜组织获取神经干细胞的试剂盒，包括独立包装的鼻黏膜细胞分离液、培养基a液和培养基b液；

3、所述鼻黏膜细胞分离液以dmem/f12为基础培养基，还包含体积分数为10～30％的富血小板血浆(prp)、表皮生长因子(egf)5～30ng/ml和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)5～30ng/ml；

4、所述培养基a液以dmem/f12为基础培养基，还包含体积分数为1～5％的b27添加剂、egf 5～30ng/ml和bfgf 5～30ng/ml；

5、所述培养基b液以dmem/f12为基础培养基，还包含有体积分数为1～5％的b27、神经生长因子(ngf)5～20ng/ml、egf 5～20ng/ml、bfgf 5～20ng/ml、脑源性神经营养因子(bdnf)5～20ng/ml、胰岛素0.55μl/l、氢化可的松0.8μl/l和转铁蛋白0.2mg/l。

6、本发明还提供了上述试剂盒从鼻黏膜组织提取神经干细胞的方法，包括以下步骤：

7、(1)将新鲜鼻黏膜组织与鼻黏膜细胞分离液进行混合培养，7～14天后获取分离的神经前体细胞；

8、(2)消化步骤(1)得到的神经前体细胞，利用培养基a液重悬后培养7天；

9、(3)将步骤(2)得到的细胞置于培养基b液中继续培养7天，得神经干细胞球。

10、优选的，步骤(1)所述混合培养前，还包括利用生理盐水溶液清洗所述鼻黏膜组织，并破碎所述鼻黏膜组织，得鼻黏膜组织块。

11、优选的，将所述鼻黏膜组织块与鼻黏膜细胞分离液混合后，种植于细胞培养瓶中进行培养，待细胞爬出后，每隔3天更换一次所述鼻黏膜细胞分离液。

12、优选的，步骤(2)所述消化包括利用胰酶对细胞密度为90％的神经前体细胞进行消化。

13、优选的，利用浓度为0.25％的胰酶消化所述神经前体细胞30s，1000rpm离心5min，并用pbs溶液清洗两次。

14、优选的，步骤(2)所述培养过程中，每两天更换一次所述培养基a液。

15、优选的，步骤(3)所述继续培养过程中，每两天更换一次所述培养基b液。

16、优选的，所述更换的方法包括半量换液。

17、优选的，步骤(1)所述混合培养、步骤(2)所述培养和步骤(3)所述继续培养的温度均为37℃，co2浓度均为5％。

18、有益效果：本发明提供了一种从鼻黏膜组织提取神经干细胞的试剂盒，包含独立包装的鼻黏膜细胞分离液、培养基a液和培养基b液。基于本发明所述试剂盒从鼻黏膜组织提取神经干细胞，以细胞生长因子为主的诱导方式，分阶段从鼻黏膜组织如嗅黏膜组织标本中提取神经干细胞，可高效快速地从鼻黏膜中获取神经干细胞球。本发明神经干细胞的提取组织原料来源丰富且稳定，自体获取无伦理问题；培养获得的神经干细胞效率高，获得的神经干细胞球表达神经干细胞标志物nestin、vimentin，符合nsc各项指标，并可以进一步分化分化为神经元及神经胶质细胞，有利于其未来在临床上推广。

技术特征：

1.一种从鼻黏膜组织提取神经干细胞的试剂盒，其特征在于，包括独立包装的鼻黏膜细胞分离液、培养基a液和培养基b液；

2.基于权利要求1所述试剂盒从鼻黏膜组织提取神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)所述混合培养前，还包括利用生理盐水溶液清洗所述鼻黏膜组织，并破碎所述鼻黏膜组织，得鼻黏膜组织块。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，将所述鼻黏膜组织块与鼻黏膜细胞分离液混合后，种植于细胞培养瓶中进行培养，待细胞爬出后，每隔3天更换一次所述鼻黏膜细胞分离液。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)所述消化包括利用胰酶对细胞密度为90％的神经前体细胞进行消化。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，利用浓度为0.25％的胰酶消化所述神经前体细胞30s，1000rpm离心5min，并用pbs溶液清洗两次。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)所述培养过程中，每两天更换一次所述培养基a液。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(3)所述继续培养过程中，每两天更换一次所述培养基b液。

9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，所述更换的方法包括半量换液。

10.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)所述混合培养、步骤(2)所述培养和步骤(3)所述继续培养的温度均为37℃，co2浓度均为5％。

11.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)(2)所述神经前体细胞其cd271及nestin阳性率均高于90％。

技术总结
本发明公开了一种从鼻黏膜组织提取神经干细胞的试剂盒及提取方法，属于细胞诱导及培养技术领域。本发明提供了一种从鼻黏膜组织提取神经干细胞的试剂盒，包含独立包装的鼻黏膜细胞分离液、培养基A液和培养基B液。基于本发明所述试剂盒从鼻黏膜组织提取神经干细胞，以细胞生长因子为主的诱导方式，分阶段从鼻黏膜组织中提取神经干细胞，可高效快速地从鼻黏膜中获取神经干细胞球。本发明神经干细胞的提取无伦理问题，培养获得的神经干细胞效率高，获得的神经干细胞球表达神经干细胞标志物，符合神经干细胞各项指标，有利于其未来在临床上推广。

技术研发人员：卢明,李文水,卢文,刘钰
受保护的技术使用者：卢明
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10