一种新型自组装贻贝黏蛋白及应用

本发明涉及蛋白质的设计领域，具体地说，涉及一种新型自组装贻贝黏蛋白及应用。

背景技术：

1、贻贝黏蛋白是一种由海洋贻贝分泌的蛋白质，使得它们能够在潮湿和动态的海洋环境中牢固地附着在各种表面上。这种黏附能力主要归功于贻贝黏蛋白中含有的一系列特殊氨基酸，如含有儿茶酚基团的dopa（3,4-二羟基苯丙氨酸）。这些化学结构赋予了贻贝黏蛋白出色的湿态粘附和耐水性能。

2、鉴于贻贝黏蛋白的卓越粘附特性和生物相容性，其作为原料被广泛的开发应用，以便满足各种应用需求，在生物医学领域，可应用于黏膜组织、皮肤组织、骨骼、软组织等手术切口和创口的粘接；在科研领域，可将其作为细胞和组织培养液的添加剂，促进培养细胞的贴壁生长；在材料学领域，通过各种化学改性和交联作用而开发的贻贝黏蛋白水凝胶具有优异的吸水性、膨胀性、多孔性和较强的吸附能力。

3、为了满足上述需求，从20世纪80年代开始美国biopolymers公司从海洋贻贝足腺中直接提取天然足丝蛋白mfp-1、mfp-2和 mfp-3，混合后制成商业化黏合剂“cell-tak”，用于动物细胞组织培养的辅助试剂。然而，这种从海洋生物体内直接提取黏附蛋白的方式并没有被广泛采纳和使用，主要是因为直接提取黏附蛋白具有局限性，是一种高难度、非经济、产量低的获取方式。为了克服这些困难，kitamura,et al于1999年首次尝试利用大肠杆菌表达贻贝 mytilus edulis 足蛋白 mefp-1，但由于该蛋白产量较低，无法用于后续研究。自2004年后，人们成功将先进的基因工程手段用于海洋生物黏附蛋白制备，试图提高蛋白的产量和纯度。但是，通过基因工程获得贻贝黏蛋白其纯化条件较为极端，得率不高，且在自然界中，贻贝黏蛋白发挥作用实际是个复杂的过程，并涉及各种高阶组装的结构特性，目前不管是提取的还是基因工程合成的天然贻贝黏蛋白，其固有的特性较为单一匮乏，需进一步赋予蛋白多级组装的特性使其可以组装成更高层次的材料，以更好的提高其性能，更好的满足实际需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对上述问题，拟从自然仿生的角度出发，挖掘贻贝粘蛋白特定的区域，并引入合适的额组装区域，协同两者的功能，以更好的发挥出各自的优势，包括在分离纯化和材料组装方面。同时可利用细胞工厂进行高效适配表达，并推动绿色生物制造，更好的实现贻贝黏蛋白材料的推广应用。为此，本发明提供一种新型自组装贻贝黏蛋白，以解决现有重组贻贝黏蛋白产量低、性能单一匮乏的问题。

2、为了实现上述的发明目的，本发明提供以下技术方案

3、一种新型自组装贻贝黏蛋白，由贻贝黏蛋白核心功能区域(core musseladhesive protein, cmap)和自组装功能区域（self-assemble protein,sap）所构成，两个区域的组合方式采用两嵌组合模型或是三嵌组合模型；其中两嵌组合模型的顺序为n端-自组装功能区域-贻贝黏蛋白核心功能区域-c端，三嵌组合模型的顺序为n端-自组装功能区域-贻贝黏蛋白核心功能区域-自组装功能区域-c端。

4、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，所述两嵌组合模型或是三嵌组合模型支持引入连接linker，包括柔性linker和刚性linker。

5、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，所述的贻贝黏蛋白核心功能区域的氨基酸序列如seq id no.1所示。所述贻贝黏蛋白核心功能区域是通过偶联多维度信息挖掘获取的一段贻贝黏蛋白关键特征序列，其中多维度信息挖掘，涵盖一级序列层面的比对分析、三维结构层面的比对分析、以及分子演化特征的分析。多维度信息的偶联分析，重点聚集在一段或多段具有多维度信息一致的局部区域，并关注其氨基酸的组成分布，以及表面电荷与亲疏水分布。该策略可推广应用在涉及分子演化的各类物种相关蛋白的挖掘，包括贻贝黏蛋白的5型、3型、6型、1型。作为优选的，所述的贻贝黏蛋白核心功能区域cmap的如seq id no.1所示。

6、所述的一级序列层面的比对分析，其具体分析为从ncbi下载贻贝黏蛋白的核酸序列中的cds区域对应的蛋白序列，获得蛋白质的一级序列信息。将得到的蛋白序列利用mega程序中的clustalw程序对得到的所有的贻贝黏蛋白进行序列比对，然后使用最大似然法构建系统发生树，执行了1000次迭代的引导测试，进一步美化得到的进化树，应用meme suite进行基于贻贝黏蛋白的蛋白序列的motif分析，然后，通过meme网站查看motif的详细信息，并保存数据。所述的三维结构层面的比对分析，其具体分析为将获得所有贻贝黏蛋白的一级序列信息，通过alphafold2蛋白建模平台进行建模，从plddt图中选择质量最高的模型，用pymod软件对模型进行分析，利用apbs tool对表面静电势能进行分析。

7、所述的分子演化特征分析，其具体分析为从ncbi下载贻贝黏蛋白的核酸序列中的cds区域，获得核酸层面的一级序列信息，通过mega的muscle(conda)比对功能，完成基于密码子的cds序列的多序列比对，并进行系统发育树的构建，利用easycodeml进行格式净化，去除掉枝长、bootstrap 值信息，仅保留树的拓扑结构信息。选择 branch model 模型，进行枝模型检测，选择枝位点模型来检测（branch site model）各个分支上正选位点。整理上述检测结果到 excel 表格中，并借助 excel 的转置、数据分列、函数和数据筛选与排序功能对得到的选择位点进行记录并对其统计分析。

8、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，所述自组装功能区域是以vpgxg五肽基本单元为基础上，对其第四位x客座残基替换为天然粘附蛋白的特征氨基酸实现仿生设计，其结构模式为[(vpgyg)(vpg(x/z)g)]n，富含酪氨酸残基；其中v为缬氨酸,p为脯氨酸, g为甘氨酸，y为酪氨酸；x为酪氨酸或任意一种带正电荷的氨基酸；z为除脯氨酸之外任意一种疏水性分数大于2.5的疏水性氨基酸；n为大于或者等于1的整数。

9、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，所述带正电荷的氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸；所述z为异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸；所述n为10、15、30、40或60。

10、本发明中，所述的自组装区域sap其特征在于是通过仿生设计获得的，具体是通过分析自然界中以贻贝为代表的粘蛋白的特征界面粘附氨基酸的种类，将其合理的引入到vpgxg基本序列单元的第四位客座残基中，同时兼顾天然粘附结构的结构特征，引入相关的协同残基，以调整模块的亲疏水特性。

11、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，所述vpgxg基本序列单元中的第四位x客座残基为缬氨酸和酪氨酸，重复单元n为10，最终的结构模式为[(vpgyg)(vpgvg)]10，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

12、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，所述自组装功能区域位于n端，贻贝黏蛋白核心功能区域位于c端，两者直接串联排列，形成两嵌模型，中间无需linker，其氨基酸序列如seq id no.3所示。本发明中，所述的组装区域sap与贻贝黏蛋白核心功能区域cmfp的组合方式，其特征在于可采用两嵌式组合或是三嵌式组合。具体来说，两嵌模型蛋白借助n端的组装模块实现层级堆叠，以组装模块为核心，形成纤维状的结构，纤维表面可暴露展示出粘附模块，以空间堆叠的方式得以充分富集粘附残基，三嵌模型蛋白可借助两端的组装模块实现非共价交联，充分拉伸粘附模块，整体上形成网络状结构。两嵌模型组合顺序可为n端-cmfp-sap-c端，三嵌模型组合顺序可为n端-sap-cmfp-sap-c端，其中，各单元之间可以支持引入连接linker，包括柔性linker，如(gggs)n和刚性linker，如(eaaak)n。作为优选的，组装区域sap位于n端，贻贝黏蛋白核心功能区域cmfp位于c端，两者直接串联排列，形成两嵌模型，中间无需linker，其包含seq id no.3所示的氨基酸序列。

13、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，所述新型自组装贻贝黏蛋白的全基因核苷酸序列如seq id no.4所示。

14、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，采用酸碱溶剂进行ph调控，形成不同的组装聚集结构，具有不同材料性能；本发明的新型自组装贻贝黏蛋白sa-cmfp可以通过酸碱溶解。作为优选的，酸碱溶剂为挥发性弱酸弱碱溶液，具体来说碱性溶剂为ph11.5的1.5%的氨溶液，ph2.5的酸性溶液为10%的乙酸溶液。低浓度的氨溶液和乙酸溶液作为挥发性的有机弱酸弱碱，以及其中和形成的盐可以在冻干过程挥发。具体来说，通过1.5%的氨溶液或10%的乙酸溶液配置一定浓度的sa-cmfp蛋白溶液，将其以一定体积涂覆在不同规格的细胞培养皿上后，通过挥发酸碱溶剂，在培养皿上形成sa-cmfp形成涂层，然后将细胞铺在培养皿或板上，以促进细胞贴壁粘附。作为优选的，最终单位面积的培养皿/孔上的sa-cmfp蛋白含量为2.5ug蛋白/cm2。作为优选的，调控ph为9.8左右后5000rpm离心1min可形成具有粘性的丝状黏胶，具有拉丝性能，调控ph为5.5左右后5000rpm离心1min可形成乳液状，表现出良好的成膜能力，可涂覆在皮肤表面形成薄膜。

15、作为优选的，在上述的新型自组装贻贝黏蛋白中，可以在体外进行酪氨酸酶、脯氨酸羟化酶羟化修饰，或者在大肠杆菌体内通过共表达酪氨酸酶、脯氨酸羟化酶的方法进行体内羟基化修饰。本发明所述的新型自组装贻贝黏蛋白sa-cmfp因富含酪氨酸和脯氨酸，可以被羟化修饰，可通过体外进行酪氨酸酶、脯氨酸羟化酶进行羟化修饰，也可在大肠杆菌体内通过共表达酪氨酸酶、脯氨酸羟化酶的技术方法进行体内羟基化修饰。经羟基化修饰后生成的多巴残基更够赋予蛋白更强的黏附能力，同时经羟基化修饰后的多出的羟基基团可以提供更多的修饰位点，进一步提高其后续交联的灵活可调性能。作为优选的酪氨酸修饰条件为15 mmol/l 抗坏血酸、20 umol/l 的硫酸铜、20 mmol/l 磷酸盐缓冲液(ph 7.6)和20 u 的酪氨酸酶， 室温下搅拌 3 h，修饰 mfp-3p 蛋白的酪氨酸残基为 dopa，修饰终点加入冰乙酸调节料液 ph 至 3.2。

16、上述新型自组装贻贝黏蛋白的制备方法，利用基因工程的方式进行生物合成和表达筛选，组合为[(vpgyg)(vpgvg)]10-cmfp,表达载体为pet20b（+）,表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)；通过温度相变和洗涤离心的方式实现分离纯化。

17、包括以下步骤：

18、（1）用一定体积的缓冲溶液a将菌体破碎。作为优选的缓冲溶液a为50mm的tris-hcl（ph 8.7），菌体湿重和缓冲溶液体积比为1g:10ml。

19、（2）收集破菌上清，放置在40℃的水预锅中，孵育2min后，弃上清，离心收集沉淀。收集破菌沉淀。

20、（3）用等体积的缓冲溶液b重悬上述沉淀并合并，室温下磁力搅拌一定时间后，弃上清，离心收集沉淀。作为优选的缓冲溶液b的组成为50mm的tris-hcl，1m脲，0.5%trixton-x100（ph 8.7），搅拌时间为1h,离心转速为10000rpm,离心时间20min。

21、（4）用等体积的缓冲溶液c重悬上一步收集到的沉淀，室温下磁力搅拌一定时间后，弃上清，离心收集沉淀。作为优选的缓冲溶液c的组成为50mm的tris-hcl（ph 8.7），搅拌时间为1h，离心转速为10000rpm,离心时间20min。

22、（5）用等体积的超纯水重悬上一步收集到的沉淀，室温下磁力搅拌1h后，弃上清，离心收集沉淀。作为优选的搅拌时间为1h。离心转速为12000rpm,离心时间30min。

23、上述新型自组装贻贝黏蛋白在制备促细胞粘附、抗菌、止血、修复或粘合的医疗器械或化妆品中的应用。本发明的新型自组装贻贝黏蛋白sa-cmfp具有良好的宏观粘合能力，能用于不同材料的粘合和软硬组织的粘合，包括皮肤组织、骨组织。作为优选的，其用于粘合时的组装材料为碱性条件下溶解后或是调控ph为9.8左右后形成的冻干纤维。进一步的，本发明的新型自组装贻贝黏蛋白sa-cmfp调控形成的组装体再经过短时间的冷冻干燥后，遇湿即黏，实现了及时粘合，同时具有良好的粘附止血能力，可以用于创面止血领域。

24、本发明提供的新型自组装贻贝黏蛋白的设计开发策略可以拓展到其他同类蛋白的设计应用中，能高效的进行生物合成与简便快速纯化，且具有灵活的自组装特性可形成不同蛋白基材料以用于细胞粘附、吸附止血、组织粘合等多个领域。