本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用，涉及一种南极假丝酵母脂肪酶b(candida antarctica lipase b，calb)突变体蛋白及其应用。
背景技术：
1、脂肪酶具备高效催化水解、转酯等反应的能力，广泛应用于食品、医药等多个行业。其中，微生物来源的脂肪酶已成为工业主流。工业催化常需高温环境，既能加快反应速率、提升反应物溶解度，还能降低微生物污染风险、节省冷却成本。然而，天然微生物脂肪酶高温下易失活，极大限制其工业应用。因此，研发高耐热、高活性的脂肪酶对工业发展至关重要。
2、南极假丝酵母脂肪酶b(calb，pdb id：1tca)分子量33.5kd，拥有s105-asp187-his224催化三联体和thr40-gln106氧负离子洞的典型结构。其催化性能依赖独特三维构象，凭借特异性底物结合口袋，兼具出色的酯合成与水解活性，且在区域、对映选择性上表现优异。calb因非水相体系中稳定性高、催化活性强，被广泛用于药物中间体合成、生物柴油制备及食品加工等领域。但野生型calb(wt)不仅热稳定性欠佳，酶活水平难以匹配日益增长的工业催化需求，双重瓶颈制约了其在高温工业场景中的应用。因此，提升calb的最适反应温度、耐热性及催化活性，对拓展其在工业领域的应用范围具有重要意义。
3、二十二碳六烯酸(dha)是一种长链ω-3多不饱和脂肪酸(pufa)，常温下呈无色、带鱼腥味的透明液体，因在大脑和视网膜发育中发挥关键作用，被称为“脑黄金”。作为人体必需脂肪酸，dha无法自主合成，需通过外界摄取。其分子结构包含长碳链和六个双键，多重不饱和双键使其化学性质活泼易氧化，因此自然界中dha几乎均以甘油酯形式存在。
4、提高脂肪酶催化特性的途径主要包括天然筛选、蛋白质工程改造、固定化技术、化学修饰及介质工程优化等。其中，蛋白质工程改造作为分子改造手段，主要包含定向进化和理性设计两种途径。现有方法通常可提升酶的单一或两种特性，但关于同时提高酶的最适反应温度、耐热性及催化活性等多种催化特性的报道较少。
5、根据已发表的文献和专利，提高calb的热稳定性方法主要包括蛋白质工程改造、固定化技术、化学修饰及介质工程优化。蛋白质工程通过理性设计引入合适的突变位点如专利(cn202010100869.9)对146位、278位和151位氨基酸进行定点突变，获得突变体a146g-l278m和a146g-l278m-a151p，热失活温度分别提升3.3℃和4.2℃，最适反应温度提高5℃且催化效率提高了4.1倍。
6、专利(cn201110406922.9)通过半理性设计对calb基因定点饱和突变，获得d223g、l278m单/双突变体，双突变体48℃半衰期为野生型13倍，半失活温度提升12℃，最适温度提高6.5℃，单突变体l278m催化效率提高40％，48℃半衰期提升6.4倍，最适温度上升2.5℃；专利(cn201610428122.x)以calb催化残基为中心，按b-factor值筛选高柔性残基突变，获突变体f344ile/met的t50提升7.7-7.9℃，催化效率为野生型0.94-1.23倍；突变体varb3最适温度、t50及tm均升13-15℃，半衰期延长40倍，催化效率不变。
7、专利(cn202311334304.7)通过定向突变获得的calb突变体，其催化酯键水解活力提升3.2～4.9倍、转酯活力提升2.21倍，且在80℃下热稳定性显著提高。kim等通过b因子分析结合rosettadesign算法预测calb热稳定性，筛选出tm值提升2.3℃的突变体r249l(kimet al.,2010)。xie等在活性中心附近定向突变获得双突变体，其48℃半衰期为野生型14倍，tm值提高3.6℃(xie et al.,2014)。zhang等利用两轮易错pcr技术获得突变体23g5和195f1，其70℃半衰期达野生型20倍，且水解活性提升(zhang et al.,2003)。
8、尽管研究人员对于calb改造进行了大量的研究，但是，上述通过定向突变获得的calb突变体仍存在热稳定性欠佳，酶活水平难以匹配日益增长的工业催化需求，双重瓶颈制约其在高温工业场景中的应用等问题，这些问题已成为长期以来亟待解决而又一直无法解决的技术难题。
技术实现思路
1、本发明所要解决的问题是针对现有的南极假丝酵母脂肪酶b(calb)热稳定性欠佳，酶活水平难以匹配日益增长的工业催化需求，双重瓶颈制约其在高温工业场景中的应用等问题，提供一种calb的突变体蛋白，其通过酶工程分子改造获得具有优异的热稳定性和较高的酶活力，从而拓宽calb在工业上的应用。
2、为此，本发明第一方面提供了一种南极假丝酵母脂肪酶b的突变体蛋白，其序列包含位于原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第195位s与f的突变、第195位s与y的突变、第283位a与y的突变中的一个或几个。
3、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为1号calb突变体蛋白，其序列中包含位于原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第195位s与f的突变；优选地，所述1号calb突变体蛋白的序列如seq id no.2所示。
4、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为2号calb突变体蛋白，其序列中包含位于原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第195位s与y的突变；优选地，所述2号calb突变体蛋白的序列如seq id no.3所示。
5、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为3号calb突变体蛋白，其序列中包含位于原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第283位a与y的突变；优选地，所述3号calb突变体蛋白的序列如seq id no.4所示。
6、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为4号calb突变体蛋白，其序列中包含位于原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第195位s与f的突变、第283位a与y的突变；优选地，所述4号calb突变体蛋白的序列如seq id no.5所示。
7、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为5号calb突变体蛋白，其序列中包含位于原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第195位s与y的突变、第283位a与y的突变；优选地，所述5号calb突变体蛋白的序列如seq id no.6所示。
8、本发明第二方面提供了一种编码本发明第一方面所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.7所示的核苷酸序列中的从5′端到3′端方向的第584位c与t的突变、第584位c与a的突变、第847位g与t的突变、第848位c与a的突变、第849位a与c的突变中的一个或几个。
9、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码1号calb突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.7所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第584位c与t的突变；优选地，所述编码calb突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.8所示。
10、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码2号calb突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.7所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第584位c与a的突变；优选地，所述编码calb突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.9所示。
11、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码3号calb突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.7所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第847位g与t的突变、第848位c与a的突变、第849位a与c的突变；优选地，所述编码calb突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq idno.10所示。
12、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码4号calb突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.7所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第584位c与t的突变、第847位g与t的突变、第848位c与a的突变、第849位a与c的突变；优选地，所述编码calb突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.11所示。
13、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码5号calb突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原calb的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.7所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第584位c与a的突变、第847位g与t的突变、第848位c与a的突变、第849位a与c的突变；优选地，所述编码calb突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.12所示。
14、根据本发明，所述核苷酸分子为如下dna分子：
15、(a1)编码区包括如seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seqid no.12所示的核苷酸序列的dna分子；
16、(a2)核苷酸序列如seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seqid no.12所示的核苷酸序列的dna分子；
17、(a3)与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列具有95％及以上的同一性，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的dna分子；
18、(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第一方面中的所述的蛋白质的dna分子。
19、本发明第三方面提供了一种含有本发明第四方面所述的核苷酸分子的表达盒。
20、本发明第四方面提供了一种含有本发明第四方面所述的核苷酸分子的重组载体。
21、在本发明的一些实施例中，所述重组载体为pgapz(mα)a。
22、本发明第五方面提供了一种含有本发明第四方面所述的核苷酸分子的重组微生物。
23、在本发明的一些实施例中，所述重组微生物的宿主细胞为毕赤酵母。
24、本发明第六方面提供了一种如本发明第二方面所述的突变体蛋白的制备方法，其包括将本发明第五方面中的所述的重组微生物进行发酵培养，获得南极假丝酵母脂肪酶b的突变体蛋白。
25、在本发明的一些实施例中，将所述重组微生物进行发酵培养包括将重组微生物的种子液转移至ypd发酵培养基，48h后加入甘油诱导，25～32℃，180～220rpm摇床培养；优选地，所述重组微生物的种子液的od 600为2～5。
26、本发明第七方面提供了如本发明第一方面所述的突变体蛋白或由本发明第二方面所述的核苷酸分子或如本发明第三方面所述的表达盒或如本发明第四方面所述的重组载体或如本发明第五方面所述的重组微生物或如本发明第六方面所述制备方法制得的突变体蛋白在生物化工领域中的应用。
27、优选地，所述生物化工领域包括食品、制药、生物能源或化工领域。
28、进一步优选地，所述应用包括合成dha甘油酯和提高calb的催化效率。
29、本发明提供了一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体蛋白。具体地，本发明在野生型脂肪酶基因序列的基础上，通过理性设计和定点突变，最终获得了具有更高热稳定性和较高酶活力的calb突变体s195f、s195y、a283y、s195f-a283y和s195y-a283y。与野生型野生南极假丝酵母脂肪酶b相比，s195f最适温度提高了8～10℃，s195y、a283y、s195f-a283y、s195y-a283y，最适温度均提高了5℃；tm值分别提高了5.7℃、6.1℃、6.2℃、6.8℃和6.0℃；五者比酶活分别是野生型的1.7，1.27，1.23，1.17和0.83倍；以未孵育的酶液酶活力为100％，70℃条件下孵育60min，五者的酶活保留率分别是82％、82％、57％、100％和96％，明显要高于野生型酶活保留率；s195f突变体的催化效率为野生型的4.5倍，s195y和a283y突变体的催化效率分别为野生型的3.8和2.3倍，s195f-a283y和s195y-a283y突变体的催化效率分别为野生型的3.9和3.15倍。将该突变体蛋白用于催化二十二碳六烯酸(dha)甘油酯合成时，展现出更高催化效率，有效提高了dha甘油酯的产量。因此，与野生型脂肪酶相比，本发明提供的南极假丝酵母脂肪酶b突变体耐热性和最适反应温度有明显提高，具有良好的热稳定性及酶活力，并且催化活性有所提升，有利于工业应用。