专利名称:一种老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及SNP领域，特别涉及与老年黄斑变性相关的SNP。
背景技术：
老年黄斑变性(age-relatedmacular degeneration, AMD),被认为是一类以进行性中心视力下降及黄斑部视网膜色素上皮变性为特征的异质性疾病，是全球成人致盲的首要疾病之一，全世界患病人数1000万，我国60-69岁人群AMD患病率为7.77%，70岁以上可达15.33%。黄斑变性包括老年黄斑变性、黄斑营养不良(stargart病、best病、sorsby眼底营养不良等)。
近年来研究认为，黄斑变性是一组异质性疾病，很多研究显示其具有显著的遗传倾向。目前，关于老年黄斑变性疾病的易感性遗传标记研究较多，如，在公告号:101173314BU01550451B的专利文件、公开号:101857899A的专利申请文件中，公开了老年黄斑变性疾病的易感性遗传标记及其在制备老年黄斑变性疾病检测试剂中的用途。但是，关于老年黄斑变性疾病的抗性遗传标记研究极少。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒。
本发明提供 了 5种变异碱基，变异碱基I为A，位于SKIV2L基因位点rs429608 ；变异碱基II为C，位于SKIV2L基因位点rs2075702 ;变异碱基III为C，位于RDBP基因位点rs760070 ;变异碱基III为C，位于RDBP基因位点rs3880457 ;变异碱基III为A，位于RDBP基因位点 rs9501161。
SNP是Single Nucleotide Polymorphism的缩写，中文翻译为单核苷酸多态性,是指基因组上单个核苷酸的变异。前述5个变异碱基属于单核苷酸变异的结果。
本发明还提供了检测SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异的相关试剂在制备老年黄斑变性疾病的筛查试剂中的用途。
其中，所述的试剂包括检测SKIV2L基因位点rs429608G — A变异、位点rs2075702T — C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs388045H — C变异或/和位点rs9501161G —A变异的试剂；还包括任选的用于扩增包含SKIV2L基因位点rs429608、位点rs2075702、RDBP基因位点rs760070、位点rs3880457或/和位点rs9501161的基因片段的试剂。
其中，所述检测SKIV2L基因位点rs429608G —A变异、位点rs2075702T —C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs388045H — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为Snapshot试剂。
其中，所述检测SKIV2L基因位点rs429608G —A变异、位点rs2075702T —C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs388045H — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为测序用试剂。
其中，所述检测SKIV2L基因位点rs429608G —A变异、位点rs2075702T —C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
本发明还提供了一种老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异的相关试剂。
其中，它包括检测SKIV2L基因位点rs429608G — A变异、位点rs2075702T — C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G —A变异的试剂；还包括任选的用于扩增包含SKIV2L基因位点rs429608、位点rs2075702、RDBP基因位点rs760070、位点rs3880457或/和位点rs9501161的基因片段的试剂。
优选地，所述的检测SKIV2L基因位点rs429608G — A变异、位点rs2075702T — C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为Snapshot试剂。
优选地，所述的检测SKIV2L基因位点rs429608G — A变异、位点rs2075702T — C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为测序用试剂。
优选地，所述的检测SKIV2L基因位点rs429608G — A变异、位点rs2075702T — C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
本发明首次阐明了 SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异是老年黄斑变性疾病的保护型变异，前述变异可以有效降低老年黄斑变性疾病的患病几率。使用本发明提供的试剂盒，可以有效筛查待检人群的对老年黄斑变性疾病的抗性，评估待检人群患老年黄斑疾病的可能性，应用前景良好。
本发明的测定方法测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。
染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点，SNP在人群中大多只有两种等位型，故亦称为双等位标记，其检测是一种“+/
图1Snapshot检测SNP rs429608位点的基因分型图谱[0021]图2Snapshot检测SNP rs2075702位点的基因分型图谱
图3Snapshot检测SNP rs760070位点的基因分型图谱
图4Snapshot检测SNP rs3880457位点的基因分型图谱
图5Snapshot检测SNP rs9501161位点的基因分型图谱
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
用于下列实施例中表示试剂均为市售品，其英文缩写如下。
需要时，用高压锅(120°C，20分钟)灭菌
EDTA:乙二胺四乙酸二钠
SDS:十二烷基硫酸纳
TE: IOmM Tris-HCl (pH7.5)、ImM EDTA (pH8.0)
dNTP:脱氧核苷三磷酸
实施例1样本收集和基因组DNA的提取
样本是由四川省医学科学院 四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室承担的国家自然科学基金课题(课题号:30771220，81170882)收集的病例。共计收集老年黄斑变性患者370例，平均年龄68.7± 10.9岁，其中男性占199例占53.8%，对照632例，平均年龄69.4±9.2岁，其中男性326例占51.6%。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。
根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml人外周血在3000rpm离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2%NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在3000rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入IOmM Tris-HCl (pH8.0)和IOmM EDTA (4ml)，以悬浮该沉淀物。将10%SDS,25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16iil和20 yl，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37°C过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟，除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC (pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70%的乙醇洗涤以获得基因组DNA。最后将所得的基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液浓度校正至50ng/yl，置_20°C冰箱保存。
实施例2 包含 rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457 以及 rs9501161 单核苷酸多态性DNA片段的PCR扩增和基因型分析
本发明采用Snapshot 基因分型技术对 rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457以及rs9501161五个位点进行检测。采用基因扩增试剂及Snapshot引物A-E分别按照下述方法进行分型。[0037]实验步骤如下:
1、PCR:95°C变性5分钟；95°C 30秒、55°C退火30秒、72°C延伸45秒，35个循环；72°C延伸7分钟，4°C保温。
2、纯化1:PCR产物各取1-3 μ I (根据需混合的PCR个数而定，总量为9 μ 1，加入混合液 3μ I (SAP2y I, I =IOExol 酶 1μ I)。1:10Exol 酶的配制:1 体积 Exol 酶，I 体积SAPlOXbuffer, 8 体积 ddH20。程序:37°C lh, 75°C 15min。
3、Snapshot 反应:Snapshot MULT IP LEX I μ I, purified PCR mixl μ I, Snapshot引物每个为 0.2 μ 1，DDH2O 补足 5 μ I。程序:96°C I 分钟，96°C 10 秒，50°C 5 秒，60°C 30秒,cycle to step2for25more times, 12°C保温。
4、纯化2:每个反应加SAP0.5-1.(^1，程序:371: I小时，75°C 15分钟，4°C保温。
5、I μ I上述产物加9 μ I HD。程序:95°C，5分钟，迅速置冰上，冷却后上机检测。
PCR 弓丨物对 A (rs429608):
F: 5，-GTAAGGGCAGTTTGGGTGAA-3’
R: 5，-GAGCCACTGTACAGCATGGA-3，
PCR 弓I物对 B (rs2075702):
F: 5，-GCTGAGATGTGTCGCTCACT-3，
R: 5，-GACTCAGGACCTCCCATCAC-3，
PCR 引物对 C (rs760070):
F: 5 ’ -TGGATGTCTGCAAAAACCAG-3，
R: 5，-CTGGATTCCTTGTGCCTCAT-3，
PCR 弓丨物对 D (rs3880457):
F: 5，-ATGAGGCACAAGGAATCCAG-3’
R: 5，-GGTTGGCACAAAGGAGCTAA-3’
PCR 引物对 E (rs9501161):
F: 5 ’ -CCATCCCTTAGGGCAACATA-3，
R: 5，-ACACAGCCACAGCAACAGAG-3’
所得到的扩增序列如下:
序列I (rs429608) 429bp:
GTAAGGGCAGTTTGGGTGAAgaagaggagcacctgagcttctggggcatg[0061 ]cttccacgagggctccatgtgggagaggaagtgcgggccatgagtctgcg
gagggactggctaacttcatgctctcttcccagcaccatctacacttcgc
ccatcaaggccctgagcaaccagaagttccgggacttccgaaacacattc
ggggatgtggggctgctcaccggggatgtacagctgcatccggaggcctc
ctgcctcatcatgaccacagagatccttcggtgagagatggacactcaat
acaggggagttttggctgggaagatgtggccgttgtggagagtgtgctgt
ctgaggagggggtggagacgagccactggG/Agagtcaatccttggcctctt
ctccccagcTCCATGCTGTACAGTGGCTC
序列2 (rs2075702) 339bp:
GCTGAGATGTGTCGCTCACTgcggggggcagcccgcctggtaggagagcc
权利要求
1.5种变异碱基，其特征在于: 变异碱基I为A，位于SKIV2L基因位点rs429608 ； 变异碱基II为C，位于SKIV2L基因位点rs2075702 ； 变异碱基III为C，位于RDBP基因位点rs760070 ； 变异碱基III为C，位于RDBP基因位点rs3880457 ； 变异碱基III为A，位于RDBP基因位点rs9501161。
2.检测SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异的相关试剂在制备老年黄斑变性疾病的筛查试剂中的用途。
3.根据权利要求
2所述的用途，其特征在于:所述的试剂包括检测SKIV2L基因位点rs429608G — A 变异、位点 rs2075702T — C 变异、RDBP 基因位点 rs760070 变异 T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂；还包括任选的用于扩增包含 SKIV2L 基因位点 rs429608、位点 rs2075702、RDBP 基因位点 rs760070、位点 rs3880457或/和位点rs9501161的基因片段的试剂。
4.根据权利要求
3所述的用途，其特征在于:所述检测SKIV2L基因位点rs429608G—A变异、位点rs2075702T — C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为Snapshot试剂。
5.根据权利要求
3所述的用途，其特征在于:所述检测SKIV2L基因位点rs429608G—A变异、位点rs2075702T — C变异、RDBP基因位点rs760070变异T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为测序用试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
6.一种老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒，其特征在于:它包括任选的用于检测SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异的相关试剂。
7.根据权利要求
6所述的试剂盒，其特征在于:所述的试剂包括检测SKIV2L基因位点rs429608G — A 变异、位点 rs2075702T — C 变异、RDBP 基因位点 rs760070 变异 T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂；还包括任选的用于扩增包含 SKIV2L 基因位点 rs429608、位点 rs2075702、RDBP 基因位点 rs760070、位点 rs3880457或/和位点rs9501161的基因片段的试剂。
8.根据权利要求
7所述的试剂盒，其特征在于:所述的检测SKIV2L基因位点rs429608G — A 变异、位点 rs2075702T — C 变异、RDBP 基因位点 rs760070 变异 T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为Snapshot试剂。
9.根据权利要求
7所述的试剂盒，其特征在于:所述的检测SKIV2L基因位点rs429608G — A 变异、位点 rs2075702T — C 变异、RDBP 基因位点 rs760070 变异 T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为测序用试剂。
10.根据权利要求
7所述的试剂盒，其特征在于:所述的检测SKIV2L基因位点rs429608G — A 变异、位点 rs2075702T — C 变异、RDBP 基因位点 rs760070 变异 T — C、位点rs3880457T — C变异或/和位点rs9501161G — A变异的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
专利摘要
本发明公开了SKIV2L基因位点rs429608、rs2075702以及RDBP基因位点rs760070、rs3880457、rs9501161的变异碱基。本发明还公开了检测前述碱基变异的试剂在制备老年黄斑变性疾病的筛查试剂中的用途，以及老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒。本发明试剂盒，可用于老年黄斑变性的辅助性诊断，以及个体老年黄斑变性疾病的抗性评估。
文档编号C12Q1/68GKCN103215265SQ201310176231
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月14日
发明者杨正林, 鲁芳, 刘小琦, 石毅 申请人:四川省医学科学院(四川省人民医院)导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan