专利名称:提高桑氏链霉菌kj40产几丁质酶的培养基及几丁质酶含菌制剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种提高桑氏链霉菌KJ40产几丁质酶的培养基及几丁质酶含菌制剂和应用。
背景技术：
微生物菌种的生产能力只有在最适发酵条件下才能得到充分发挥。优良微生物菌种的生产水平受多种因素制约，包括培养基配方、初始pH、培养温度、接种条件、供氧水平等。发酵培养基是微生物生长的物质基础，其组成和配比对菌体生长、抗生物质发酵单位、提炼工艺、产品质量等都有相当大的影响。发酵培养基的改良是提高发酵水平的一个重要的途径，必须包含满足微生物的能量、元素和特殊养分，其中各种化合物的种类和浓度对菌体生长繁殖以及产物的质量和产量都有重要的影响。由于微生物种类不同，在发酵过程中所使用的培养基也有所不同，通常培养基的原料主要有碳源、氮源、无机盐类、微量元素和水等。碳源是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质，一般占微生物细胞干物质的50%左右。由于各种微生物生理特性的不同，其所能利用的碳源种类也有所不同。常用的碳源有碳水化合物、脂肪、有机酸和醇、碳氢化合物等。氮源是构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质，是微生物发酵中使用的主要原料之一。有些氮源物质可参与合成抗菌物质前体，可对一些特殊代谢产物的合成起到调节作用[174175]。常用的氮源有有机源和无机氮源两大类，有机氮源包括黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、玉米浆、豆柏、麸皮、酵母粉、蛋白陈、鱼粉和酒糟等；无机氮源有尿素、氨水、硫酸氨、氯化氨和硝酸盐等。微量元素和无机盐是微生物在生产繁殖和产物合成中所需要的。金属离子对微生物生理活性的影响大多与其浓度有关，低浓度通常表现为刺激诱导作用，高浓度表现出抑制作用，最适浓度要根据微生物特性和发酵条件来确定。水是培养基的主要组成成分，对微生物的生产繁殖和产物合成有着重要的作用，它既是构成菌体`细胞的主要成分，又是一切营养物质传递的介质。在有些发酵中，营养缺乏是抗菌物质开始合成的条件，因此培养基中各营养元素的添加量对发酵生产也至关重要。
在发酵培养基配方确定的情况下，提高发酵水平的另一个重要的途径是选择合适的培养条件，包括温度、种龄、接种量、初始pH、溶氧量和发酵时间等。温度对菌体生长和代谢产物形成的影响是各种因素综合表现的结果[m]，如温度可通过影响发酵液中溶解氧影响发酵。从酶反应动力学来看，温度升高，反应速度随之加大，代谢加快，产物提前产生，但菌体却易于衰老进而影响产物合成。接种量大小与菌株种龄和在培养基中的生长繁殖速度有关，接种量大则种子进入发酵罐后较容易适应，从而缩短菌体繁殖至高峰所需的时间，力口快产物合成速度；但过大的接种量通常会使菌体生长过快而造成营养基质缺乏或溶解氧不足，不利于发酵；接种量过小则会使发酵前期菌体生长缓慢，延长发酵周期，菌丝量少，还可能形成菌丝团，导致发酵异常。菌体在生长过程中，不同生长阶段的生理活性差别较大，发酵过程中种龄的控制就尤为重要。通常以菌体处于生命力旺盛的对数生长中后期为宜，此时的种子浓度大，质量高，接入适宜的量后，能较快地适应环境，有利于缩短发酵周期。每种微生物都有自己生长的最适pH值，在发酵过程中，pH值的变化不仅能改变体系酶的环境和营养物质的代谢流，还能使得诱导物和生长因子在活性和非活性之间变化。放线菌生长的最适pH范围为6-8，一般在培养基中加入一定的缓冲物质来维持稳定的pH值。溶解氧是影响微生物发酵的又一重要因素，会对代谢产物的合成途径和合成速度产生影响[179]。通常在放线菌发酵过程中，菌体密度过大会造成发酵液粘稠，进而引起反应器中溶氧过低，但溶氧过高又会引起菌丝断裂或结成小球，从而对菌体的生长和产物的合成造成影响，所以需要调整溶氧量来改善这些状况。发酵时间的长短也是发酵生产中一个非常重要的指标，可直接影响代谢产物的产率和质量。
本研究对桑氏链霉菌KJ40 (桑氏链霉菌KJ40本申请人已于2012年4月25日以菌种形式申请了专利，中国专利申请号201210122697.0发明名称:桑氏链霉菌KJ40菌株及其液体制剂，公开号CN102703343A)产几丁质酶的发酵培养基配方进行了优化，以期能够大幅提闻菌株酶活性含量。提闻防治效果。
几丁质酶作为一种抗菌蛋白是生防菌抑制病原真菌的重要机制之一。合适的培养基成分和培养条件对于提高几丁质酶产量必不可少，碳源、氮源、PH值等都与微生物产几丁质酶密切相关。因此人们在提高微生物的产几丁质酶量时，必须对发酵条件进行适当调控，以确定该菌最适的产酶条件，为更强抑制真菌的孢子萌发和菌丝生长，激发植物启动防御反应，使植物产生更多的防御蛋白，增强植物的抗性提供基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种提高桑氏链霉菌KJ40产几丁质酶的培养基及几丁质酶含菌制剂和几丁质酶含菌制剂的应用。
本发明中的桑氏链霉菌KJ40本申请人已于2012年4月25日以菌种形式申请了专利，中国专利申请号201210122697.0发明名称:桑氏链霉菌KJ40菌株及其液体制剂，公开号 CN102703343A。
本发明的技术方案如下:
一种提高桑氏链霉菌KJ40产几丁质酶的培养基，所述培养基为:溶度为2% (w/V)的胶体几丁质 100ml/L，黄豆饼粉 0.4wt%，K2HPO4L O (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
所述的培养基制备的几丁质酶含菌制剂，将所述桑氏链霉菌KJ40种子接入所述培养基中，然后置于恒温摇床上，于26°C, 140r/min振荡培养144小时,制成几丁质酶含菌制剂。
所述的几丁质酶含菌制剂在制作预防杨树紫根病药剂中的应用，将所述几丁质酶含菌制剂按照体积比50-100倍稀释，沿杨树苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春、夏
季施各用一次。
与产酶基础培养基(胶体几丁质200ml，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，M gS04.7H200.5g，FeSO4 *7H200.0lg, ZnSO40.0Olg，蒸馏水1000ml，pH7.0)相比，本发明的新配方及发酵条件生产的几丁质酶活性提高约80%。用上述几丁质酶含菌制剂50-100倍(体积比)稀释度沿杨树苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春、夏季施各用一次，可预防杨树紫根病的发生。
图1为发酵时间对酶活的影响；
图2为不同碳源对发酵产酶的影响；
图3为氮源对发酵产酶的影响；
图4为初始pH值对菌株112903产几丁质酶的影响；
图5为温度对产酶活性的影响；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
在产酶基础培养基上，通过添加碳源、氮源、等单因素实验，确定培养基的成分，设计4因素3水平的正交实验，获得菌株在4因素的影响下产酶的最佳配比是:胶体几丁质(胶体几丁质水溶液的溶度为2%，w/V) 100ml/L,黄豆饼粉0.4%，K2HPO4L O (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。其中对产酶影响最大的是氮源含量，其次为K2HPO4的含量，相比之下底物浓度和KH2PO4含量对产酶的影响较小。
1.1培养时间与产酶的关系
以产酶基础培养基(胶体几丁质200ml，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，M gS04.7H200.5g，FeSO4.7H200.0lg, ZnSO40.0Olg，蒸馏水1000ml，pH7.0)为初始培养基。将配置好的培养基分装至IOOml三角瓶中，每瓶20ml，121 °C灭`菌30min，冷却后每瓶接入Im浓度为107/ml的孢子悬液，每个平行样品设3次重复，然后置于恒温摇床上，于25°C，140r/min振荡培养，每24小时测定一次几丁质酶活力。测定方法参照DNS法。绘制生防链霉菌的产酶曲线。
实验结果如图1所示，在产酶基础培养基中，桑氏链霉菌在最初的2d中产酶量比较低，但从第3天到第6天的时间内酶活显著增加，并在第6天时酶活达到最大。此后随培养时间的延长，培养液中几丁质酶活性开始下降。因此在以后的实验中，选择第6天作为最佳酶活力的测定时间。
1.2碳源对链霉菌产几丁质酶的影响
在基础培养基中添加1%的各种碳源，以基础培养基为对照。碳源有以下几种:葡萄糖，N-乙酰-D-氨基葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，甘油、淀粉。研究各种碳源对产酶的影响。每瓶接入Im浓度为IOVml的孢子悬液，每个平行样品设3次重复，然后置于恒温摇床上，于25°C，140r/min振荡培养。第六天测定几丁质酶活力。测定方法参照DNS法。
在基础培养基中，以100ml/L的胶体几丁质与0.1%的其它碳源作为复合碳源进行发酵对比实验，结果如图2，以葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、NAG、作为添加碳源时，吸光度达到仪器的极限值，无法估算其中的几丁质酶含量。添加蔗糖和甘油的培养基发酵液的酶活力低于以胶体几丁质作为唯一碳源的酶活力，蔗糖和甘油对产酶有一定的抑制作用，以胶体几丁质作为唯一碳源时产酶效果最好。
1.3氮源对链霉菌产几丁质酶的影响
在基础培养基中添加0.2wt%的各种氮源，以基础培养基为对照，考察不同氮源对产几丁质酶的影响，无机氮源有(NH4) 2S04、NH4NO3^ KNO3 ;有机氮源有蛋白胨(黄豆饼粉)、牛肉膏。[0029]在基础培养基中分别添加几种单一有机或无机氮源，结果见图3，以蛋白胨为氮源时酶活力最高，其次是牛肉膏；采用单一无机氮源时产酶都较低。
1.4产酶培养基配方的优化
表I拮抗菌(桑氏链霉菌)发酵培养基组分正交实验因素编码表
权利要求
1.一种提高桑氏链霉菌KJ40产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基为:溶度为 2% (w/V)的胶体几丁质 100ml/L,黄豆饼粉 0.4wt%，K2HPO4L O (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
2.根据权利要求
1所述的培养基制备的几丁质酶含菌制剂，其特征在于，将所述桑氏链霉菌KJ40种子接入所述培养基中，然后置于恒温摇床上，于26°C，140r/min振荡培养144小时，制成几丁质酶含菌制剂。
3.根据权利要求
2所述的几丁质酶含菌制剂在制作预防杨树紫根病药剂中的应用，其特征在于，将所述几丁质酶含菌制剂按照体积比50-100倍稀释，沿杨树苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春 、夏季施各用一次。
专利摘要
本发明公开了一种提高桑氏链霉菌KJ40产几丁质酶的培养基及几丁质酶含菌制剂和应用，所述培养基为溶度为2%(w/V)的胶体几丁质100ml/L，黄豆饼粉0.4wt%，K2HPO41.0(g/L)，KH2PO40.6(g/L)。与产酶基础培养基相比，本发明的新配方及发酵条件生产的几丁质酶活性提高约80%。用上述几丁质酶含菌制剂50-100倍(体积比)稀释度沿杨树苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春、夏季施各用一次，可预防杨树紫根病的发生。
文档编号A01N63/02GKCN103088005SQ201310038610
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月31日
发明者朱天辉, 李姝江, 雷美艳, 张丽娜, 谯天敏 申请人:四川农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan