专利名称:高效降解高分子量多环芳烃的细菌分离方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术和环境生物技术领域：
，具体涉及高分子量多环芳烃类污染土壤的生物修复。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上苯环以稠环和非稠环形式相连接的有机化合物。PAHs在环境中普遍存在，其极低的水溶性、稳定的环状结构是造成这类化合物持久性的主要原因。人类及动物癌症病变有70%-90%是环境中化学物质引起的，而PAHs则是环境致癌化学物质中最大的一类。由于这类化合物具有致癌、致畸和致突变的特性，对人类健康和生态环境均具有潜在的危险而引起世界各国的普遍重视。
研究发现自然界中多种微生物能够降解多环芳烃，但因高分子量的多环芳烃性质稳定，强疏水性物质，易被土壤颗粒吸附或被其它作用固定，隔断其与专性微生物和酶的直接接触，从而影响其降解速率。天然的水体和土壤是微生物的大本营，存在着数量巨大的各种各样微生物，在遭受有毒有害的有机物污染后，可出现一个天然的驯化选择过程，使适合的微生物不断增长繁殖、数量不断增多。因此，微生物降解被认为是污染物在自然界中降解的主要途径，应用现代生物技术进行环境污染治理和监测是解决当今社会环境污染问题的重要途径。从受污染的地区土壤筛选分离出PAHs的降解优势菌株，再将其投回到污染环境，或者寻求适宜高效降解PAHs菌群生长的工艺条件，是进行修复多环芳烃污染土壤的关键环节。
近年来对降解PAHs的微生物进行了广泛的研究，常见的微生物有红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobac-terium)、气单胞菌属(Aeromonas)、拜叶林克氏菌属(Beijernckia)、棒状杆菌 属(Corynebacterium)、蓝细菌(Cyanobacteria)、微球菌属(Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、白腐真菌(White rot fungi)和弧菌属(Vibrio)等。经国家知识产权局专利检索系统检索，在“一种多环芳烃降解菌剂的制备方法(公开号CN 101423807A)”中，利用新型菌株Mycobacterium sp. SN12,经过7天，对花和菲的降解率分别为91. 5%和95. 2%。在“一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法(公开号CN 101177679A)”中，42天后微球菌对芘和苯并芘的降解率分别为30. 7%和25. 7%，动胶杆菌对芘和苯并芘的降解率分别为31. 4%和21. 9%。在“一种可高效降解苯并[a]芘的不动杆菌及其应用(公开号CN 102174445A)”中，经过20天后在苯并[a]芘浓度40mg/L的无机盐培养基中，37°C振荡，菌株对苯并[a]芘的降解率达28. 66%，同样条件下，加入适量蔗糖或葡萄糖，可提高该菌对苯并[a]芘的降解率达48. 87%。在“一种多环芳烃降解菌及其应用(公开号CN 1844361A)”中，鞘氨醇单胞菌属菌株GY2B对菲的降解速率在36h后为91. 7%-97. 8%。“一种产生生物乳化剂和降解多环芳烃的赤红球菌Em及用途(公开号CN1519312)”中，该菌剂对蒽、菲、芘均有降解效果。综上所述，在针对多环芳烃降解相关的已公开的专利信息中，大部分都是围绕单一菌种对PAHs的降解效果，而且基本都是基于实验室条件下液体培养基中的降解效果验证，其中有一部分菌剂经在污染土壤中的处理效果并不是很理想。
事实上，环境中通常以多种组分的污染物同时存在，呈现为复合污染现象。在实际场地修复中，单纯通过投加通过实验室优化条件分离驯化的单体微生物，难以让其在恶劣的污染环境中定植，并成为该污染环境中的主要菌群而发挥其高效降解效果。研究表明，混合菌群作为一种多菌体共存的生物群体，在其生长过程中能分解有机物，同时依靠各种微生物之间相互共生增殖及协同代谢作用降解环境中的有机物，并能激活其他具有净化功能的微生物，从而形成复杂而稳定的微生态系统。在“一种多环芳烃高效降解菌系及其应用(公开号CN101196810)”中，7天后GP3混合菌系对芘的降解率为75. 7%_99. 5%。在“去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂及其应用”(公开号CN101851582 A)专利中，公布了红球菌、微杆菌、苍白杆菌和博德特氏菌组成的菌剂，4周后，添加该菌剂的土壤中16种多环芳烃的去除率比未添加该菌剂的土壤中的平均提高了 30%，其中6种低环(二 /三环)多环芳烃的去除率提高了 26%，10种中高环(四环及以上)多环芳烃的去除率平均提高了 32%，说明复合菌在混合污染场地中的应用前景。
综上可以看出，在针对多环芳烃降解相关的已公开的现有技术中，大部分都是围绕单一菌种对PAHs的降解效果，而且基本都是基于实验室条件下液体培养基中的降解效果验证，其中有一部分菌剂的降解效果是在低浓度多环芳烃污染土壤中进行的。针对高浓度污染土壤，特别是四环及以上多环芳烃高污染老化土壤的处理效果较好的菌剂相关技术，报道甚少。
本发明是通过PCR-DGGE技术，分析多环芳烃污染土壤中投加菌剂后，其微生态环境中微生物多样性的变化与污染物降解相关性，跟踪添加菌剂在环境中的定植来确定菌剂的功效。
发明内容
本发明提供了一种多环芳烃类污染场地中分离筛选高效降解细菌复合体的方法及其应用，该方法是利用PCR-DGGE技术，迅速确定土壤样品中污染物降解相关优势菌群及其分离纯化，优化组合，扩大培养，重新投放到长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，通过定期投加适量的不同配比的营养元素及其湿度的控制(40-60%)，持久保持高效降解菌群的优势。该方法降解效率高，特别是针对高分子量多环芳烃污染的土壤。
本发明同时提供了一种跟踪高效降解菌在环境中的定植的技术。
本发明提供的一种多环芳烃降解细菌复合体的分离、筛选方法包括如下步骤
I)培养基中加入PAHs的方法在灭菌三角瓶中加入不同浓度PAHs的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，加入下述细菌培养基I，使芘终浓度为终浓度为200mg/L,苯并花总浓度为10mg/L。
细菌培养基1:硫酸铵2. 5g，硫酸亚铁O. 28mg，磷酸氢二钠1. 5g，磷酸二氢钾1.36g，硫酸镁O. 25g，氯化钙10. 7mg,氯化钠O. 5g，氯化铁O. 004g,1. OmL微量金属液A、ImL维生素复合溶液，加水至IOOOmL并将pH控制在7. 2-7. 4，摇匀后作为液体培养基备用，若为固体培养基，则加入1. 5%琼脂粉。其中微量金属液A的组成为=CoCl2 · 6H2035mg, CuCl2
O.20mg，H3BO3 6. Omgj MnCl2 · 4H20 25mg，Na2MoO4 · 2H20 3. Omgj NiCl2 · 2H202.Omg, ZnCl22. 5mg,加水至IOOOmL ;维生素复合溶液的组成为维生素B61. Omg,维生素C1.5mg，加水至 IOOOmLo
2)在150ml三角瓶中加入50ml灭菌蒸馏水，加入IOg新鲜高浓度PAHs污染土壤，25-30°C,90rpm条件下培养5天后，取IOml分别接种至上述含多环芳烃的IOOml无机盐培养基中，同样条件下培养10天，测定污染物降解效果。
3)确定高效降解功能的目标菌群通过PCR-DGGE方法，分析上述两种污染物富集的样品中优势囷群，以两种污染物为唯一碳源S集培养液中都存在的囷株确定为目标囷株。取1. 5ml细菌培养液提取总DNA，选取细菌16S rDNA V3区进行PCR扩增。制备Imm厚10% (w / v)聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为30%-70% (100%变性剂组成为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)。加样后，置于lXTAE缓冲液中45V电泳16h。电泳完毕，取下凝胶，EB上染色。DGGE凝胶经EB染色后，在紫外灯下将凝胶中较亮的条带用洁净的刀片小心切下。将目的条带置于30 μ I灭菌超纯水中，-20°C放置过夜。PCR前65°C水浴溶解IOmin,取DNA浸出液作为模板进行PCR扩增，扩增产物再用DGGE电泳确认所回收条带的正确位置。然后PCR扩增纯化，完成测序。序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析。
4)分离纯化目标菌株
A、通过划线和稀释平铺两种接种的方式，分别接种于上述细菌培养基I和II制成的固体培养基平板上，30°C恒温培养箱培养至菌落生长，16S rRNA鉴定。细菌培养基I1:氯化钠lg，酵母浸出粉O. 5g，蛋白胨lg，蒸馏水1L，1. 5%琼脂粉。
B、细菌的鉴定根据其形态特征及其16S rRNA基因序列鉴定。
2、降解效果验证及菌剂的优化
实验设置2个方案，目的是根据不同污染物降解效果，确定高效降解细菌的最佳组合。设置不加菌悬液 的作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效果。
方案一苯并芘和芘作为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加入培养好的单一细菌，室温90rpm条件下,避光摇床培养2,4,6,8,10天(花为唯一碳源)或5,10，15，20，30，40，50，60天(苯并芘为唯一碳源)，设置不加菌悬液+污染物作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效果。
方案二 苯并芘和芘作为唯一的碳源，再加入上述细菌培养基I，使污染物终浓度分别为10mg/L和200mg/L。依据上述3)通过PCR-DGGE分析结果，将上述4)分离纯化的优势菌株进行组合，室温90rpm条件下,避光摇床培养2,4,6,8,10天(花为唯一碳源)或5,10，15，20，30，40，50，60天(苯并芘为唯一碳源)，设置不加菌悬液+污染物作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效果。
3、菌液的制备
上述分离纯化的各菌株利用下述培养基接种，室温90rpm条件下，摇床培养24_48小时得到，细菌的数量保持在5X IO8 5X101(lCFU/ml之间。所用培养基为每20L上述细菌培养基I溶液中，混合10g_20g葡萄糖，乙酸钠3-15g。
4、高浓度多环芳烃污染土壤中投加高效降解菌的菌跟踪及降解效果验证
I)将上述3中获得的菌液等量比例混合后，按照10ml/100g污染土壤的量，投放到长期污染的含有高分量多环芳烃污染土壤中。常温下，通过定期投加适量的不同配比的上述微量元素A，保持环境中的40-60%的水分含量。间隔10天，定期检测土壤中污染物浓度的变化。
2)高效降解菌的跟踪监测。
高浓度污染土壤中添加上述菌剂后，依照不同处理时间，分别称取O. 25 g 土壤样品，利用"powersoi IDNAi solat i ο η K i t " (Mobio 公司)，提取基因组。选取细菌16S rDNA V3区进行PCR扩增。制备Imm厚10% (w / v)聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为30% — 70% (100%变性剂组成为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)。加样后，置于IXTAE缓冲液中45V电泳16h。电泳完毕，取下凝胶，EB上染色。DGGE凝胶经EB染色后，在紫外灯下将凝胶中较亮的条带用洁净的刀片小心切下。将目的条带置于30 μ I灭菌超纯水中，-20°C放置过夜。PCR前65°C水浴溶解lOmin，取DNA浸出液作为模板进行PCR扩增，扩增产物再用DGGE电泳确认所回收条带的正确位置。然后PCR扩增纯化，完成测序。序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析。
5、本发明所提供的三种高效降解菌来源于上海某工业园区重度污染土壤，经过人工富集培养、分离纯化获得。经16S rDNA鉴定分别为分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)。
本发明的高浓度高环芳烃降解细菌复合体的分离筛选方法，涉及一种细菌互营复合体的分离筛选方法。它解决了现有多环芳烃类降解菌剂降解范围较单一，单一菌种难以在复合污染环境中与土著菌间竞争的难题。本发明通过优势菌种组合，提供了一种能高效广谱降解多环芳烃的复合细菌体。
`[0030]本发明与现有技术相比，具有如下优点
1、本发明利用PCR-DGGE技术，确定污染物降解相关优势菌群及其分离纯化，分别扩大培养24-48hr，菌数达到5X IO8 5X 101(lCFU/ml。各菌按照相同的比例混合后，以10ml/100g 土壤的量，投放到长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，通过定期投加适量的不同配比的营养元素及其湿度控制(40-60%)，持久保持所投加高效降解菌群的优势。该方法降解效率高，特别是针对高分子量多环芳烃污染的土壤和水体。
2、本发明提供了一种跟踪高效降解菌在环境中的定植技术。
3、本发明还提供了一种营养元素的组合，能持久保持所投加高效降解菌群的优势。
图1 :不同污染物为唯一碳源培养复合菌16S r DNA V3区PCR-DGGE电泳图，样品1:芘(200ppm) +细菌培养基I+菌悬液A ;样品2 :苯并芘(IOppm) +细菌培养基I+菌悬液B0
图2 :三种单菌分别对芘的降解效果(芘初始浓度为200mg/L)。
图3 :三种单菌分别对苯并芘的降解效果(苯并芘初始浓度为10mg/L)。
图4 :三种菌混合对芘的降解效果(芘初始浓度为200mg/L)。
图5 :三种混合菌对苯并芘的降解效果(苯并芘初始浓度为10mg/L)。
图6 :污染土壤投加菌后不同时间处理样品16S r DNA V3区PCR-DGGE电泳图，投加菌6天后开始采集样品，时间间隔分别为6天、26天、46天、66天，1-8泳道分别表示1 加入蒸馏水调整湿度；2 :原始土壤，未加任何处理；3-5 :微量元素液调整湿度；6-8 :细菌培养基1+1%葡萄糖调整湿度。A、B、C表示所投加的菌，分别是A :投加的Acinetobactersp. ;B :投力口的 Microbacterium sp. ；C Mycobacterium sp. ;D :土著菌 Xanthomonas sp.。
具体实施方式
实施例1:
本实施例提供一种筛选高效多环芳烃降解细菌复合体的分离方法，该方法具体如下
1、在IOOml三角瓶中加入50ml灭菌蒸馏水，IOg新鲜高浓度PAHs污染土壤，25-30 V，90rpm条件下培养。
2、在两个新的灭菌三角瓶中各自加入芘和苯并芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入细 菌培养基I，使多环芳烃终浓度芘为200mg/L，苯并芘终浓度为10mg/L。接入1%体积含量的上述I中培养的细菌，25-30°C，90rpm条件下避光摇床培养10天，重复操作步骤2至步骤I细菌富集培养液对芘和苯并芘降解速率达到稳定为止，得菌悬液A和B。
3、分别步骤2中获得的菌悬液A和B各取Iml培养液均匀涂布于10mg/L苯并芘[a]和200mg/L芘的细菌培养基I和1%葡萄糖的细菌培养基I上。
4、30°C，培养2-4天，至菌落出现。从平板上挑取特征不同、生长旺盛且稳定的菌落，在含1%葡萄糖和1%乙酸钠的细菌培养基I固体平板上反复划线分离以获得纯菌种，16srRNA鉴定。
5、取菌悬液A和B各1ml，5000rpm转速下，离心3分钟，倒掉上清液，再加入500ul灭菌蒸馏水，混悬，5000rpm转速下离心3分钟，倒掉上清液，加入200ul灭菌蒸馏水，100°C煮沸5分钟，冷却。IOOOOrpm转速下离心5分钟，取上清液作为下一步16s rRNAV3区扩增的模板。
6、分别以上述I和2步骤获取的菌悬液煮沸液为模板，进行V3区PCR扩增，将获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析(图1)。
7、将步骤6中得到的含芘和苯并芘[a]不同样品的变性梯度凝胶的条带比对，以两个样品中都含有的条带和各自优势的条带作为目的片断进行回收、纯化及测序，将所得的序列片断在GenBank数据库进行同源性分析和检测。
8、综合上述步骤4和步骤7的结果，优化菌群，确定该污染土壤中主要优势降解菌株。
9、通过上述过程，筛选得到的菌株为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)不动杆菌(Acinetobacter sp.)、微杆菌(Microbacterium sp.)。
表I通过上述步骤I和步骤2富集，不同污染物为唯一碳源培养复合菌16S r DNAV3区PCR-DGGE电泳图谱
(图1)对应单个条带的序列比对分析
权利要求
1.一种筛选多环芳烃降解细菌复合体的方法，其特征在于，所述方法采用PCR-DGGE技术，迅速确定出土壤样品中污染物降解相关优势菌群及其分离纯化，优化组合，扩大培养，重新投放到长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，定期投加适量的不同配比的营养元素，并将湿度控制在40-60%范围内，持久保持高效降解菌群的优势。
2.根据权利要求
1所述的一种筛选多环芳烃降解细菌复合体的方法，其特征在于，所述多环芳烃降解细菌复合体的分离、筛选方法包括如下步骤 1)培养基中加入PAHs:在灭菌三角瓶中加入不同浓度PAHs的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，加入下述细菌培养基I，使芘终浓度为终浓度为200mg/L，苯并芘总浓度为10mg/L ； 细菌培养基1:硫酸铵2. 5g，硫酸亚铁O. 28mg，磷酸氢二钠1. 5g，磷酸二氢钾1. 36g，硫酸镁O. 25g，氯化钙10. 7mg,氯化钠O. 5g，氯化铁O. 004g,1. OmL微量金属液A、ImL维生素复合溶液，加水至IOOOmL并将pH控制在7. 2-7. 4，摇匀后作为液体培养基备用，若为固体培养基，则加入1. 5%琼脂粉，其中微量金属液A的组成为CoCl2 *6H2035mg, CuCl2O. 20mg,H3BO36. Omg, MnCl2 *4H2025mg, Na2MoO4 · 2H20 3. Omg, NiCl2 · 2H20 2. Omg, ZnCl22. 5mg,加水至IOOOmL ;维生素复合溶液的组成为维生素B61. Omg，维生素H O. 5mg，维生素C 1.5mg，加水至 IOOOmL ； 2)在150ml三角瓶中加入50ml灭菌蒸馏水，加入IOg新鲜高浓度PAHs污染土壤，25-30°C,90rpm条件下培养5天后，取IOml分别接种至上述含多环芳烃的IOOml无机盐培养基中，同样条件下培养10天，测定污染物降解效果； 3)确定高效降解功能的目标菌群通过PCR-DGGE方法，分析上述两种污染物富集的样品中优势菌群，以两种污染物为唯一碳源富集培养液中都存在的菌株确定为目标菌株，取1. 5ml细菌培养液提取总DNA，选取细菌16S rDNA V3区进行PCR扩增，制备Imm厚10%(w / v)聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为30% -70%，加样后置于I X TAE缓冲液中45V电泳16h，电泳完毕，取下凝胶，EB上染色，DGGE凝胶经EB染色后，在紫外灯下将凝胶中较亮的条带用洁净的刀片小心切下，将目的条带置于30μ I灭菌超纯水中，_20°C放置过夜，PCR前65°C水浴溶解lOmin，取DNA浸出液作为模板进行PCR扩增，扩增产物再用DGGE电泳确认所回收条带的正确位置，然后PCR扩增纯化，完成测序，序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析； 4)分离纯化目标菌株 A、通过划线和稀释平铺两种接种的方式，分别接种于上述细菌培养基I和II制成的固体培养基平板上，30°C恒温培养箱培养至菌落生长，16S rRNA鉴定，细菌培养基I1:氯化钠lg，酵母浸出粉O. 5g，蛋白胨lg，蒸馏水1L，1. 5%琼脂粉， B、细菌的鉴定根据其形态特征及其16SrRNA基因序列鉴定。
3.根据权利要求
2所述的一种筛选多环芳烃降解细菌复合体的方法，其特征在于，100%变性剂的组成为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺。
4.一种筛选高效多环芳烃降解细菌复合体的分离方法，其特征在于该方法包括如下步骤 (I)在IOOml三角瓶中加入50ml灭菌蒸馏水，IOg新鲜高浓度PAHs污染土壤，25-30°C，90rpm条件下培养；(2)在两个新的灭菌三角瓶中各自加入芘和苯并芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入细菌培养基I，使多环芳烃终浓度芘为200mg/L，苯并芘终浓度为10mg/L，接入1%体积含量的上述I中培养的细菌，25-30°C，90rpm条件下避光摇床培养10天，重复操作步骤2至步骤I细菌富集培养液对芘和苯并芘降解速率达到稳定为止，得菌悬液A和B ; (3)分别步骤2中获得的菌悬液A和B各取Iml培养液均匀涂布于10mg/L苯并芘[a]和200mg/L芘的细菌培养基I和1%葡萄糖的细菌培养基I上； (4)30°C，培养2-4天，至菌落出现，从平板上挑取特征不同、生长旺盛且稳定的菌落，在含1%葡萄糖和1%乙酸钠的细菌培养基I固体平板上反复划线分离以获得纯菌种，16srRNA鉴定； (5)取菌悬液A和B各Iml，5000rpm转速下，离心3分钟，倒掉上清液，再加入500ul灭菌蒸馏水，混悬，5000rpm转速下离心3分钟，倒掉上清液，加入200ul灭菌蒸馏水，100°C煮沸5分钟，冷却，IOOOOrpm转速下离心5分钟，取上清液作为下一步16s rRNAV3区扩增的模板； (6)分别以上述I和2步骤获取的菌悬液煮沸液为模板，进行V3区PCR扩增，将获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析； (7)将步骤6中得到的含芘和苯并芘[a]不同样品的变性梯度凝胶的条带比对，以两个样品中都含有的条带和各自优势的条带作为目的片断进行回收、纯化及测序，将所得的序列片断在GenBank数据库进行同源性分析和检测； (8)综合上述步骤4和步骤7的结果，优化菌群，确定该污染土壤中主要优势降解菌株; (9)通过上述过程，筛选得到的菌株为分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)不动杆菌(Acinetobacter sp.)、微杆菌(Microbacterium sp.)。
5.根据权利要求
1-4任一项所述的细菌复合体在降解多环芳烃中的应用。
专利摘要
本发明涉及高分子量多环芳烃类污染土壤的生物修复。具体提供了一种多环芳烃类污染场地中分离筛选高效降解细菌复合体的方法及其应用，该方法利用PCR-DGGE技术，迅速确定土壤样品中污染物降解相关优势菌群及其分离纯化，优化组合，扩大培养，重新投放到长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，通过定期投加适量的不同配比的营养元素及其湿度的控制(40-60%)，持久保持高效降解菌群的优势。该方法降解效率高，特别是针对高分子量多环芳烃污染的土壤。
文档编号C12N1/20GKCN103045507SQ201210537032
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月12日
发明者金京华, 程言君, 高振, 郭鹏, 罗霂, 宋云 申请人:轻工业环境保护研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan