专利名称:一株高产丙酮酸的大肠杆菌菌株的构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙酮酸的生产方法，特别涉及一种构建用于发酵生产丙酮酸的大肠杆菌菌株的方法和生产丙酮酸的方法，属于微生物工程技术领域：
。
背景技术：
丙酮酸是一种重要的有机中间体，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。丙酮酸是机体代谢的中间产物，处于糖酵解途径的末端，同时又连接着EMP途径和TCA循环，处于代谢途径中的关键代谢节点，在细胞中很容易代谢为其他产物，难以积累，只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢，才能达到使其在细胞中积累并分泌到胞外的目的。
目前用于丙酮酸生产菌株有酵母、放线菌和细菌等。工业生产所用菌株主要是酵母，其中以球拟酵母的研究和应用最多，如专利公开号CNlOl 157941A中披露通过控制葡萄糖浓度和维生素浓度来提高多重营养缺陷型光滑球拟酵母(Torulopsis glabuata)CCTCCM202019发酵生产丙酮酸的能力，在30°C发酵92h后，丙酮酸产量为91.2g/L，糖酸转化率为0.75g/g。根据专利公开号CN1740330A所述，利用皮状丝孢酵母9070 (CGMCC0754)进行摇瓶发酵丙酮酸，在28°C发酵3天后产量最高达到43g/L。如专利公开号CN101096691A所述，利用多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(Torulopsis glabuata)发酵生产丙酮酸，通过在发酵过程中向培养基中添加2，4-二硝基苯酚(DNP)来降低菌体内能荷水平来提高丙酮酸产量，在5L发酵罐中，发酵60h丙酮酸最高达到58.9g/L。
丙酮酸脱氢酶PDH为多酶复合体，包含了三种酶:丙酮酸脱氢酶(Elp)、二氢硫辛酰转乙酰基酶(E2p)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)，催化丙酮酸脱羧，并伴随乙酰CoA的生成，这是中心代谢途径的第一步反应。其中，aceE、aceF和IpdA分别编码这三种蛋白。当敲除aceE后，PDH失去将丙酮 酸转化为乙酰CoA的能力，中心代谢途径因为没有足量的乙酰CoA供应而出现障碍，但是在培养基中添加一定量的乙酸盐，菌体可以利用乙酸盐合成乙酰CoA，从而可以弥补生长上的不足。在缺失aceE的大肠杆菌中，菌体可以利用乙酸盐而保持生长，并开始积累丙酮酸。
利用酵母产丙酮酸的发酵温度一般在30°C左右，而大肠杆菌最适发酵温度为37°C，具有发酵温度高、繁殖速度快等优点，且生产所用的酵母都为维生素等多种营养缺陷型，培养基配制比较复杂，而本发明所用的大肠杆菌遗传标记简单，只有aceE基因缺陷型，在培养基中添加一定量的乙酸盐即可发酵，发酵条件粗放，可以作为丙酮酸的生产菌株。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于敲除大肠杆菌丙酮酸脱氢酶aceE基因，以阻断丙酮酸进入TCA循环，从而构建一株用于高产丙酮酸的大肠杆菌。
其特征在于是通过同源基因双交换阻断技术，敲除大肠杆菌MG1655中的丙酮酸脱氢酶aceE基因，以获得丙酮酸高产菌株。[0008]其特征在于包括如下步骤:
(I)将 pKD46 (Ampr)转化大肠杆菌 MGI655 ；
(2)根据aceE基因及pKD3的基因序列设计并化学合成引物MaceE-F和MaceE-R ；
(3)以pKD3为模板使用⑵中引物进行PCR扩增，得到打靶片段MaceE ；
(4)将打靶片段MaceE电击转化进入大肠杆菌MG1655敲除aceE基因；
(5)根据抗性及营养缺陷表型筛选及PCR验证同源基因双交换阻断突变株；
(6)对突变株进行发酵性能验证。
其特征在于所述引物MaceE-F和MaceE-R序列分别包含aceE基因中的一段序列。
其特征在于所述引物MaceE-F和MaceE-R如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。
其特征在于所述抗性表型是氯霉素抗性。
其特征在于所述营养缺陷表型是乙酸盐依赖型。
其特征在于所述的乙酸盐是乙酸甲。
其特征在于所述PCR验证引物aceE-F和aceE-R序列如SEQ ID NO: 3和SEQ IDNO:4所示。
其特征在于敲除前和敲除后的aceE基因片段见SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6。
其特征在于所述的发酵性能验证中使用的培养基配方(g/L):葡萄糖40-105，(NH4)2S046-16,玉米浆 20-50，酵母膏 2，KAc0.5-2.0，KH2PO4I, MgSO4 7H201,FeSO4 7H200.01，MnSO4 5H200.01，碳酸钙 20-80。用 NaOH 调 pH7.0，121°C 灭菌 20min ;摇瓶种子培养条件:500mL摇瓶装液量20mL-40mL，种子培养时间8h_16h，温度31 °C _46°C，摇床转速100r/min。
本发明通过敲除大肠杆菌丙酮酸脱氢酶aceE基因，阻断丙酮酸流向TCA循环来增加丙酮酸的产量，最后测定发酵液中丙酮酸含量达到35.7g/L，糖酸转化率为0.649g/g。aceE基因的缺失会对菌体的生长造成严重障碍，采用在培养基中补加乙酸盐可以在一定程度上弥补这种生长上的缺陷。
图1是丙酮酸生物合成路线图
图2是利用Red重组敲除aceE基因的PCR鉴定电泳图
图3温度对发酵产丙酮酸酸的影响
图4碳酸钙添加量对丙酮酸合成的影响
图5装液量对丙酮酸合成的影响
图6种子培养时间对发酵的影响
图7种子接种量对发酵的影响
图8葡萄糖浓度对发酵的影响
图9硫酸铵浓度对发酵的影响
图10玉米浆浓度对发酵的影响
图11乙酸钾浓度对发酵的影响
具体实施例
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案:[0037]实施例1
采用Red同源重组敲除丙酮酸脱氢酶aceE基因，阻断了丙酮酸流向TCA循环，从而使丙酮酸累积。
将PHMe(AmPlr)转化MG1655(ATCC47076)，涂布氨苄青霉素平板，在30°C过夜培养后，挑单菌接液体氨苄青霉素LB，于30°C过夜摇。取ImL过夜摇瓶培养的菌液转接于IOOmL新鲜液体LB中(AmplOO u g/mL, L-阿拉伯糖10mmol/L),于30°C培养到OD600为0.2时，将L-阿拉伯糖浓度调为30mmol/L，继续培养至OD6tltl为0.6，冰浴20min后，4000r/min，4°C离心IOmin收集菌体，用预冷的10%甘油洗涤4次后，将菌体浓缩为ImL感受态细胞，50 y L分装后于-20°C保存。
打靶片段MaceE的获得:根据aceE基因及pKD3上的序列设计引物MaceE-F、MaceE-R,然后以pKD3为模板进行PCR，扩增出打靶片段MaceE，用DpnI隔夜消化模板后，胶回收，用适量灭菌dd H2O洗脱。
电转化体系:50 U L感受态细胞和10 ii L MaceE混匀后，加入电击杯，冰浴lOmin。
电转条件:1_电击杯，1800V，5ms，25ii F，200Q。
电转后，立即加入ImL预热到37°C的SOC (含有KAc5g/L)，37°C复苏2h，离心收集菌体后，浓缩为 200ii L，涂布两个SOB平板(Cm25ii g/mL，MgCl220mmol/L，KAc5g/L)。于 37°C培养16h后，长出阳性转化子，挑取单菌于SOB平板并用鉴定引物aceE-F和aceE-R进行菌落PCR，鉴定MaceE是否重组到aceE中，如果重组成功，则aceE基因长度从2800bp减少到1226bp。将菌落PCR鉴定正确的单菌，胶回收A aceE片段，并进行测序。如图2所示，LaneM:DL15, OOODNA Marker ；Lanel:MaceE(1146bp);Lane2:MG1655aceE PCR 产物(2800bp)；Lane3:鉴定菌 aceE PCR 产物(1226bp)。
将测序正确的菌落 接于LB (Cm25 u g/mL, KAc5g/L)中，于42°C隔夜培养后，在氯霉素抗性平板上划线培养，将长出的单菌落分别点在氯霉素抗性和氨苄青霉素抗性的平板。挑取在氯霉素抗性平板长而在氨苄青霉素抗性平板上不长的菌落即为去除PKD46的MG1655 A aceE:: cat。
实施例2
培养基及培养条件
摇瓶种子培养方法:种子培养基以g/L计:葡萄糖20，(NH4)2S0416，酵母膏2，KAc5，KH2PO4I, MgSO4 7H200.5，FeSO4 7H200.01，MnSO4 5H200.01，碳酸钙 20。用 NaOH 调 pH7.0，121°C灭菌20min。培养条件:温度37°C，摇床转速100r/min，培养时间12h。
摇瓶发酵培养方法:发酵培养基以g/L计:葡萄糖40，(NH4)2S0416，酵母膏2，KAc5，KH2PO4I, MgSO4 7H201, FeSO4 7H200.01，MnSO4 5H200.01，碳酸钙 40。用 NaOH 调 pH7.0，121°C灭菌20min。培养条件:温度37°C，摇床转速100r/min，培养时间48h。
实施例3
温度对发酵产丙酮酸酸的影响
在摇瓶条件下，分别对31 °C、34°C、37°C、40°C、43°C、46°C条件下发酵48h，考察对丙酮酸合成的影响。最终丙酮酸产量分别为21.80g/L、23.42g/L、26.61g/L、20.60g/L、
4.86g/L和1.16g/L。优先于37°C进行发酵。
实施例4[0053]碳酸钙添加量对丙酮酸合成的影响
在摇瓶条件下，分别添加20g/L、40g/L、60g/L、80g/L的碳酸|丐和不添加碳酸隹丐，于37°C发酵48h，考察碳酸钙添加量对发酵的影响。最终丙酮酸产量分别为15.30g/L、
25.13g/L、24.60g/L、23.00g/L 和 5.95g/L。优先添加碳酸钙量为 40g/L。
实施例5
装液量对丙酮酸合成的影响
在摇瓶条件下，分别对500mL三角瓶装液量20mL、25mL、30mL、35mL和40mL，于37°C发酵48h，考察对丙酮酸合成的影响。最终丙酮酸产量分别为25.18g/L、26.43g/L、24.22g/L、23.43g/L 和 22.00g/L。优先选择最佳装液量为 25mL/500mL。
实施例6
种子培养时间对发酵的影响
在摇瓶条件下，分别接种8h、10h、12h、14h和16h的种子，于37°C发酵48h，考察不同的种子培养时间对丙酮酸合成的影响。最终丙酮酸产量分别为21.84g/L、24.33g/L、24.16g/L、23.47g/L和22.28g/L。确定最佳种子培养时间为IOh0
实施例7
种子接种量对发酵的影响
在摇瓶条件 下，分别考察6%、8%、10%和12%的接种量丙酮酸合成的影响，于37°C发酵48h，丙酮酸产量分别为21.76g/L、22.41g/L、24.01 g/L和24.13g/L。鉴于接种量从10%增加到12%，丙酮酸产量增加幅度不大，考虑到培养种子的成本，优先选择接种量为10%。
实施例8
葡萄糖浓度对发酵的影响
在摇瓶条件下，分别考察40g/L、55g/L、70g/L、85g/L和105g/L的葡萄糖浓度对丙酮酸合成的影响，于37°C发酵48h，丙酮酸产量分别为23.22g/L、26.56g/L、25.23g/L、24.99g/L和22.54g/L。最终优选择葡萄糖浓度为55g/L。
实施例9
硫酸铵浓度对发酵的影响
在摇瓶条件下，分别考察6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L和16g/L的硫酸铵浓度对丙酮酸合成的影响，于37°C发酵48h，最终丙酮酸产量分别为22.68g/L、24.78g/L、24.52g/L、23.12g/L、22.59g/L 和 21.03g/L。优先选择最佳硫酸铵浓度为 8g/L。
实施例10
玉米浆浓度对发酵的影响
在摇瓶条件下，分别考察20g/L、30g/L、40g/L和50g/L的玉米浆浓度对丙酮酸合成的影响，于37°C发酵48h，丙酮酸产量分别为21.76g/L、29.80g/L、28.31g/L和27.26g/L。优先选择玉米浆浓度为30g/L。
实施例11
乙酸钾(KAc)浓度对发酵的影响
在摇瓶条件下，分别考察0.5g/L、l.0g/LU.5g/L和2.0g/L的乙酸钾浓度对丙酮酸合成的影响，于37°C发酵48h，丙酮酸产量分别为25.23g/L、26.80g/L、28.21 g/L和
26.82g/L。优先选择乙酸钾浓度为1.5g/L。[0076]实施例12
经过上述实验方案,确定最佳发酵培养基配方:发酵培养基以g/L计:葡萄糖55,玉米浆 30，(NH4) 2S048, KAcl.5，KH2PO4I, MgSO4 7H201, FeSO4 7H200.01，MnSO4 5H200.01，碳酸钙40。用NaOH调pH7.0，121°C灭菌20min。培养条件:温度37°C，摇床转速100r/min，培养时间48h。发酵工艺为种子培养时间10h，接种量为10%，于25mL/500mL摇瓶中37°C发酵培养48h，最后测定发酵液中丙酮酸含量达到35.7g/L，糖酸转化率为0.649g/g。
以上所述，仅为发明的具体实施方式
。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应当涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种高产丙酮酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于是通过同源基因双交换阻断技术，敲除大肠杆菌MG1655中的丙酮酸脱氢酶aceE基因，以获得丙酮酸高产菌株。
2.根据权利要求
1所述一种高产丙酮酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将pKD46(Ampr)转化大肠杆菌MG1655 ； (2)根据aceE基因及pKD3的基因序列设计并化学合成引物MaceE-F和MaceE-R； (3)以pKD3为模板使用(2)中引物进行PCR扩增，得到打靶片段MaceE; (4)将打靶片段MaceE电击转化进入大肠杆菌MG1655敲除aceE基因； (5)根据抗性及营养缺陷表型筛选及PCR验证同源基因双交换阻断突变株； (6)对突变株进行发酵性能验证。
3.根据权利要求
2所述的构建方法，其特征在于所述引物MaceE-F和MaceE-R序列分别包含aceE基因中的一段序列。
4.根据权利要求
2或3所述的构建方法，其特征在于所述引物MaceE-F和MaceE-R如SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 所示。
5.根据权利要求
2所述 的构建方法，其特征在于所述抗性表型是氯霉素抗性。
6.根据权利要求
2所述的构建方法，其特征在于所述营养缺陷表型是乙酸盐依赖型。
7.根据权利要求
6所述的构建方法，其特征在于所述的乙酸盐是乙酸甲。
8.根据权利要求
2所述的构建方法，其特征在于所述PCR验证引物aceE-F和aceE-R序列如 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 所示。
9.根据权利要求
2所述的构建方法，其特征在于敲除前和敲除后的aceE基因片段见SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。
10.根据权利要求
2所述构建方法，其特征在于所述的发酵性能验证中使用的培养基配方(g/L):葡萄糖 40-105，(NH4) 2S046-16，玉米浆 20-50，酵母膏 2，KAc0.5-2.0，KH2PO4I,MgSO4 7H201, FeSO4 7H200.01，MnSO4 5H200.01，碳酸钙 20-80。用 NaOH 调 pH7.0，121。。灭菌20min ;摇瓶种子培养条件:500mL摇瓶装液量20mL-40mL，种子培养时间8h_16h，温度31°C -46 °C，摇床转速 100r/min。
专利摘要
本发明涉及一种采用基因工程技术改造的高产丙酮酸的大肠杆菌株的方法，属于微生物工程技术领域：
。该菌株是敲除丙酮酸脱氢酶aceE基因的菌株。该方法是培养该菌株而生产丙酮酸。本发明通过敲除大肠杆菌丙酮酸脱氢酶aceE基因，阻断丙酮酸流向TCA循环来增加丙酮酸的产量。aceE基因的缺失会对菌体的生长造成严重障碍，采用在培养基中补加乙酸盐可以在一定程度上弥补这种生长上的缺陷。
文档编号C12R1/19GKCN103087950SQ201310009709
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月10日
发明者张伟国, 宋灿辉, 钱和 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan