专利名称:具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶的制作方法
具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶发明领域[0001]本发明提供了具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶及它们在各种应用，包括核酸多核苷酸延伸和扩增中的用途。[0002]发明背景DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间(from generation to generation)精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA 合成的酶。它们在有金属活化剂如Mg2+存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每一 DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次以产生相同的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如美国专利号4，683，202)。[0003]在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一轮DNA复制的开始时添加的(参见上述美国专利号4，683，202)。后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获得热稳定DNA聚合酶，这些酶只需要添加一次(参见美国专利号4，889，818和美国专利号 4，965，188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆地失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键。特别是对于诊断应用，目标核酸序列可能仅仅是所考察(in question)DNA或RNA的一小部分，因此在不扩增的情况下可能难以检测到目标核酸序列的存在。[0004]DNA聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，包含手掌、手指和拇指三个独特的亚结构域。(参见 beese 等，Science 260:352-355, 1993) ;Patel 等，Biochemistry 34:5351-5363, 1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但是催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，在化学催化作用期间与引入的dNTP相互作用并稳定过渡态的基序A在哺乳动物ρο α和原核生物的Pol I家族DNA聚合酶之间是重叠的，平均偏差约为IA (Wang等，Cell 89:1087 -1099，1997)。在结构上基序A以主要包含疏水性残基的反向平行β-折叠链起始，延续·到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。在基序A的情况下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:28)保留在从数百万年进化分离的生物体包括例如水生栖热菌 iThormus aquaticus)、沙眼衣原体{Chlamydia trachomatis)和大肠杆菌 ipscherichia coli)的聚合酶中。[0005]除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够容纳某些的氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如美国专利号6，602，695)。这种突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择优势。因此，本领域需要鉴别适于突变的氨基酸位置以产生改进的聚合酶活性。本发明，如同本文中所述，满足这些及其它需要。[0006]发明概述本文提供了相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶以及制备和使用这种DNA聚合酶的方法。在一些实施方案中，聚合酶是热稳定DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是热活性的DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶源自栖热菌种species)。在一些实施方案中，DNA聚合酶源自栖热袍菌种 {Thermotoga species)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的488位的DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸，除了对应于SEQ ID NO:1的488位的对照DNA聚合酶的氨基酸是S，对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的488位的位置处的氨基酸选自G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R或H。在一些实施方案中，对应于SEQ ID N0:1的488位的位置处的氨基酸选自G，A, D, F，K, C，T,或Y。[0007]在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶源自栖热菌种，对应于SEQ ID N0:1的 488位的氨基酸是在中性pH时，具有极性、不带电荷的侧链的氨基酸(除了 S，例如，N，Q, H, T或Y)，具有非极性、不带电荷的侧链的氨基酸(例如，G，A, L, M, W, P, F，C，V或 I)，具有极性、带负电荷的侧链的氨基酸(例如，D或E)，或具有极性、带正电荷的侧链的氨基酸(例如，R或K)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的488位的具有极性的、不带电荷的侧链的氨基酸是T或Y ;对应于SEQ ID NO:1的488位的具有非极性的、不带电荷的侧链的氨基酸是A，F，G，或C ;对应于SEQ ID NO:1的488位的具有极性的、带负电荷的侧链的氨基酸是D ;以及对应于SEQ ID NO:1的488位的具有极性的、带正电荷的侧链的氨基酸是K。[0008]而且，根据本发明，位于对应于SEQ ID NO:1的488位的氨基酸附近的其它氨基酸也可以被突变，以产生相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有增强的3’ -错配辨别力的酶。例如，对应于SEQ ID NO:1的493和/或497位的氨基酸的突变也产生相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有增强的3’ -错配辨别力的酶。[0009]在一些实施方案中，具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序 包含A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,其中XI是 H，E 或 Q;X2 是 P，T 或 E;X3是N或H ;X4是L或I ;X5是N或R ;X6是除S以外的任何氨基酸；X7 是 R，P，或 S ;X8 是〕，K 或 T;X9是L或V ;X10 ^ E, S，A 或 G;XII是 R，N, Y, T 或V;X12是V或I ;X13是F或Y ;X14是0或E ;和X15是￡ 或K (SEQ ID NO:8)。[0010]在一些实施方案中，X6选自 G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R 或 H (SEQ ID NO:49)。[0011]在一些实施方案中，具有增强的3’-错配辨别力的DNA聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X1J-X12-L-F-X14-X1S-L,其中X1是H或EjPX4是L或I ;X6是除S以外的任何氨基酸X7是R或PX8是D或KX9是L或VXltl是E或SX1A R 或NX12是V或IX14是D或E和X15是E或K(SEQ ID NO:9)ο[0012]在一些实施方案中，具有增强的3’-错配辨别力的DNA聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-E-R-V-L-F-D-E-L,其中X6是除S以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 10)。[0013]在一些实施方案中，X6是 G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R或H (SEQ ID N0:49)。在一些实施方案中，Xes具有非极性、不带电荷的侧链的氨基酸 (例如，G，A, L, M, W, P, F，C，V,或I)。在一些实施方案中，X6是具有极性、不带电荷的侧链的氨基酸(除了 S，例如，N，Q, H, T,或Y)。在一些实施方案中，X6是具有极性、 带负电荷的侧链的氨基酸(例如，D或E)。在一些实施方案中，X6是具有极性、带正电荷的侧链的氨基酸(例如，R或K)。在一些实施方案中，X6是6，A, D, F，K, C，T，或Y (SEQ ID NO:11)。[0014]在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D 或E以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的 DNA聚合酶的氨基酸选自L，G, T, Q, A, S，N, R和K。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是G。[0015]在一些实施方案中，DNA聚合酶进一步包含在对应于选自SEQ ID NO:1的493和/ 或497的位置的一个或多个氨基酸处的突变。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的 493位的DNA聚合酶的氨基酸是除E，S，A，或G以外的任何氨基酸。在一些实施方案中， 对应于SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的氨基酸选自Q，R, V, L, I, M, F，W, P, T, C，N, D, Y, K,或H。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的氨基酸选自K或R。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶源自栖热菌种，对应于SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸。例如，当DNA聚合酶源自栖热菌种时，DNA聚合酶进一步包含对应于SEQ ID NO:1的493位的位置处的选自S， A, G, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, K, R 或 H 的氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的493位的位置处的氨基酸选自S，A, Q, G, K,或R。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的493位的位置处的氨基酸选自A，G, K,或R。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的493位的位置处的氨基酸是K。[0016]在一些实施方案中，DNA聚合酶的氨基酸在对应于SEQ ID NO:1的497位的位置处可以进一步包含除F或Y以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID N0:1的 497 位的 DNA 聚合酶的氨基酸选自 R，V, L, I, M, W, P, T, C，N, D, E, S，A, G, K, E或H。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸选自A， G, S，T, D或K。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶源自栖热菌种，对应于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸是除F以外的任何氨基酸。因此，在一些实施方案中， 当DNA聚合酶源自栖热菌种时，对应于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸选自 R, V, L, I, M, W, P, T, C，N, D, E, S，A, G, K, E, H 或 Y。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸是A, G, S，T, Y, D,或K。[0017]各种DNA聚合酶适于本发明的突变。尤其适合的是热稳定聚合酶，包括来自各 种嗜热菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的热稳定聚合酶，以及通过氨基酸取代、插入或缺失或其它修饰而源自这种野生型或天然存在的酶的合成的热稳定聚合酶。示例性的聚合酶的未修饰形式包括例如CS5 (SEQ ID N0:29)或CS6(SEQ ID NO: 30) 或Z05 DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)，或与其具有至少80%、优选至少90%或更优选至少95% 的序列同一性的功能性DNA聚合酶。其它未修饰的聚合酶包括例如来自于下列嗜热菌中任一种的DNA聚合酶(或与这种聚合酶具有至少80%、优选至少90%或更优选至少95%的序列同一性的功能性DNA聚合酶)海栖热袍菌{Thermotoga maritima) (SEQ ID NO: 38)； 水生栖热菌 kThermus aquaticus) (SEQ ID NO:2);嗜热栖热菌(Jhermus thermophilus) (SEQ ID NO:6);黄栖热菌(Jlwrmus flavus) (SEQ ID NO:4);丝状栖热菌 iThormus filiformis) (SEQ ID NO: 3);栖热菌种 Spsl7sp. spsl7) (SEQ ID NO: 5);栖热菌种 Z05 sp. Z05) (SEQ ID NO:1);那不勒斯栖热袍菌(Jhermotoga neopolitana) (SEQ ID NO:39);非洲栖热腔菌{Thermosipho africanus) (SEQ ID NO:37) ；Thermus caldophilus (SEQ ID NO:7),耐放射异常球菌{Deinococcus radiodurans) (SEQ ID NO: 36)，嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus s tearo thermophi I us) (SEQ ID NO: 40)或热坚芽孢杆菌{Bacillus caldotenax) (SEQ ID NO:41)。合适的聚合酶还包括具有逆转录酶(RT) 活性和/或能够掺入非常规核苷酸如核糖核苷酸或其它2’ -修饰的核苷酸的那些。[0018]尽管具有有效的3’ -错配辨别力活性的热稳定性DNA聚合酶尤其适合用于进行 PCR,具有有效的3’ -错配辨别力活性的热活性的、但不是热稳定的DNA聚合酶也适于本发明的突变。[0019]在一些实施方案中，DNA聚合酶是栖热菌属DNA聚合酶。例如，在一些实施方案中， DNA聚合酶与选自下列的聚合酶具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%的序列同一性(a)栖热菌种ZOOTNA 聚合酶(ZO5) (SEQ ID NO:1);(b)水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)(SEQ ID NO: 2);(c)丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)(SEQ ID NO: 3);(d)黄栖热菌DNA 聚合酶(Tfl) (SEQ ID NO:4);(e)栖热菌种Spsl7DNA 聚合酶(Spsl7) (SEQ ID NO: 5);(f)嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)(SEQ ID NO:6);和(g)Thermus caldophilus DN A 聚合酶(Tea) (SEQ ID NO: 7)。[0020]在一些实施方案中，DNA聚合酶是栖热袍菌DNA聚合酶。例如，在一些实施方案中， DNA聚合酶与选自下列的聚合酶具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%的序列同一性(a)海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma)(SEQ ID NO: 38);(b)那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne)(SEQ ID NO: 39);在某些实施方案中，DNA聚合酶与SEQ ID NO:1具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%的序列同一性。在一些实施方案中，DNA聚合酶是栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05) DNA聚合酶(即SEQ ID NO:1)，除了 488位的氨基酸是除S以外的任何氨基酸。例如，在一些实施方案中，488位的氨基酸选自G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R或H。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，488位的氨基酸是除S以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，488位的氨基酸是A，D,F，G, K, C，T或Y。在一些实施方案中，DNA聚合酶是进一步包含580位的取代的Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA 聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸选自L，G, T, Q, A, S，N, R和K。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是G。[0021]突变的或改进的聚合酶可以包括其它非取代的修饰。一种这种修饰是热可逆的共价修饰，其使酶失活，但是在高温，如通常用于多核苷酸延伸的温度下孵育后其被逆转而激活酶。美国专利号5，773，258和5，677，152中描述了这种热可逆的修饰的示例性试剂。[0022]在一些实施方案中，通过在具有预定拷贝数的野生型BRAF V600R目标多核苷酸和预定拷贝数的突变型BRAF V600目标多核苷酸(数量上等于或少于野生型目标的拷贝数(例如，10，000或更少拷贝))的一个或多个反应混合物中在正向引物(与突变型序列完美匹配并且与野生型序列具有一个单一的3’A:C错配)存在的情况下使用具有SEQ ID N0:35(野生型BRAF = SEQ ID NO:34)的核酸序列的突变型BRAF V600R目标多核苷酸而测定3’-错配活性。两个或更多的反应混合物可以具有滴定的拷贝数的突变型BRAF V600R 目标多核苷酸(例如，在数个反应混合物中，1:5滴定，1:10滴定，例如，10，000拷贝，1000 拷贝，100拷贝，10拷贝，I拷贝，O拷贝)。如本文中所述，可以在预先选择的单位时间，将本发明的聚合酶的3’ -错配辨别力与参照聚合酶(例如，天然存在的或未修饰的聚合酶)的3’-错配辨别力相比较。当与突变型等位基因完美匹配的引物接触时，具有增强的 3’ -错配辨别力的聚合酶将不能扩增野生型序列，或者，与天然存在的或未修饰的聚合酶相比，使用突变型等位基因特异性引物扩增野生型序列将需要更大的PCR循环数(即，表现出更高的Cp值)。[0023]在各种其它方面，本发明提供了编码本文所述的突变的或改进的DNA聚合酶的重组核酸，包含该重组核酸的载体，和/或用所述载体转化的宿主细胞。在某些实施方案中， 所述载体是表达载体。包含这种表达载体的宿主细胞可用于本发明的生产突变的或改进的聚合酶的方法，所述方法通过在适于表达重组核酸的条件下培养宿主细胞。反应混合物和 /或试剂盒中可以包含本发明的聚合酶。重组核酸，宿主细胞，载体，表达载体，反应混合物和试剂盒的实施方案如上面和本文中所述。[0024]在另一方面，提供了实施多核苷酸延伸的方法。该方法总体包括在适于引物延伸的条件下将本文所述的具有增强的3’ -错配辨别力的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接触，从而产生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。三磷酸核苷可以包括非常规核苷酸如核糖核苷酸和/或标记的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一个或更多个核苷酸类似物。在一些变型中，多核苷酸延伸方法是用于多核苷酸扩增的方法，包括在适于多核苷酸扩增的条件下将突变的或改进的DNA聚合酶与引物对、 多核苷酸模板以及三磷酸核苷接触。多核苷酸延伸反应可以是，例如，PCR，等温延伸，或测序(例如，454测序反应)。[0025]在一些实施方案中，引物延伸方法是用于实施聚合酶链式反应(PCR)的方法。[0026]本发明还提供了用于这种多核苷酸延伸方法中的试剂盒。通常，试剂盒包括至少一个提供本文所述的突变的或改进的DNA聚合酶的容器。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括提供一种或更多种额外试剂的一个或更多个额外的容器。例如，在特定的变型中，一个或更多个额外的容器提供三磷酸核苷；适于多核苷酸延伸的缓冲剂；和/或在多核苷酸延伸条件下与预定的多核苷酸模板杂交的引物。进一步提供了包含本发明的聚合酶的反应混合物。反应混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一种或多种引物或探针多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，标记的核苷酸，非常规的核苷酸)，缓冲剂，盐，标记(例如，突光团)。[0028]本文描述了本发明的进一步的实施方案。[0029]定义除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管基本上与本文所述的那些相似的任何方法和材料都可用于本发明的实践或试验，但是仅仅描述了示例性的方法和材料。对于本发明的目的，下列术语定义如下。[0030]术语“一(a)，” “一(an)，”和“该(the) ”包括复数对象，除非上下文清楚地指出别的含义。[0031 ] “氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何单体单位。如本文所用，术语“氨基酸”包括下列20种天然或遗传编码的α-氨基酸丙氨酸(Ala或Α)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸 (Glu或Ε)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或 S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在其中“X” 残基没有定义的情况下，这些应该定义为“任何氨基酸”。这20种天然氨基酸的结构见例如 Stryer 等，BioChemistry, 5th ed. , Freeman and Company (2002)。额外的氨基酸如硒代半胱氨酸和卩It咯赖氨酸也能够被遗传编码(Stadtman (1996) iiSelenocysteinej ” Annu Rev Biochem. 65:83-100 和 Ibba 等.(2002) “Genetic code:1ntroducing pyrrolysine，，， Curr Biol. 12(13) :R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如， 具有修饰的侧链和/或骨架)和氨基酸类似物。参见，例如，Zhang等.(2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells, ” Proc. Natl. Acad. Sc1. U.S.A. 101 (24) :8882-8887，Anderson 等.(2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon，，Proc. Natl. Acad. Sc1. U.S.A. 101 (20) : 7566-7571, Ikeda 等· (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo, ” Protein Eng. Des. Sel. 16 (9) :699-706, Chin 等·(2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code，，，Science 301(5635) :964-967, James 等· (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues, ” Protein Eng. Des. Sel. 14(12) :983-991，Kohrer 等.(2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells:A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins, ” Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 98(25):14310-14315, Bacher 等· (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue，” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425， Hamano-Takaku 等· (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, ” J. Biol. Chem. 275 (51) :40324_40328，和Budisa等· (2001) “Proteins with {beta} -(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids, ” Protein Sc1. 10 (7):1281-1292。[0032]为了进一步说明，氨基酸典型地为包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一种或多种侧链或基团，或·这些基团的任一种的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如疏基、砸基、横酸基、焼基、芳基、酸基、丽基、置氣基、轻基、餅、氰!基、齒素、酸餅、 链烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其它代表性的氨基酸包括但不限于， 包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳 (photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、 重原子取代的氨基酸、化学可裂的和/或光可裂的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。[0033]术语“适配子”是指识别并结合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的单链DNA，如美国专利号5，693，502中所述。[0034]在本发明的DNA聚合酶上下文中的术语“突变体”是指相对于对应的天然存在的或未修饰的DNA聚合酶包含一个或多个氨基酸取代的多肽，典型为重组的。[0035]在突变型聚合酶上下文中的术语“未修饰的形式”在本文中是用来定义本发明的突变型DNA聚合酶的术语术语“未修饰的形式”是指具有除指定为表征突变型聚合酶的一个或多个氨基酸位置以外的突变型聚合酶的氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，在(a) 其未修饰的形式和(b) —个或多个特定氨基酸取代的方面提到突变型DNA聚合酶是指除特定的氨基酸取代以外，突变型聚合酶在特定的基序中另外具有与未修饰的形式相同的氨基酸序列。“未修饰的聚合酶”(和因此还有具有增强的3’-错配辨别力的修饰的形式)可以包含额外的突变以提供期望的功能性，例如双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的改进的掺入，调节5’ -核酸酶活性，调节3’ -核酸酶(或校正) 活性等。因此，在实施本文所述的本发明时，DNA聚合酶的未修饰的形式是预先确定的。DNA 聚合酶的未修饰的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已经有意识地修饰过的DNA聚合酶。聚合酶的未修饰的形式优选热稳定DNA聚合酶,如来自各种嗜热菌的 DNA聚合酶以及与野生型或天然存在的热稳定聚合酶具有基本上序列同一性的其功能性变体。这种变体可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶，如美国专利号6，228，628和美国申请公开号2004/0005599中所述的嵌合DNA聚合酶。在某些实施方案中，聚合酶的未修饰的形式具有逆转录酶(RT)活性。[0036]术语“热稳定聚合酶”是指对 热稳定的酶，其是耐热的，当经受高温并持续影响双链核酸变性所必需的时间时，其保留足够的活性以影响随后的多核苷酸延伸反应，并且没有变得不可逆变性的(失活的)。核酸变性所需的加热条件是本领域公知的，在例如美国专利号4，683，202,4, 683，195和4，965，188中举例说明。如本文所述，热稳定聚合酶适于在温度循环变化的反应如聚合酶链式反应(“PCR”)中使用。用于本文目的的不可逆变性指酶活性的永久且完全的损失。对于热稳定聚合酶，酶活性是指以适当的方式催化核苷酸的组合以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产物。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌，水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，丝状栖热菌，栖热菌种Spsl7，栖热菌种Z05, Thermus热坚芽孢杆菌,那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA 聚合酶。[0037]术语“热活性的”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反应中逆转录或退火/延伸步骤的温度(即，45-80°C )保持催化性能的酶。热稳定酶是当经受对于核酸变性所必需的高温时不会被不可逆地失活或变性的那些酶。热活性的酶可以是或可以不是热稳定的。热活性的DNA聚合酶可以是DNA或RNA依赖于嗜热种或依赖于嗜常温种，包括但不限于，大肠杆菌，莫洛尼小鼠白血病病毒和禽成髓细胞瘤病毒(Avian myoblastosis virus) 0[0038]如本文使用的，“嵌合”蛋白是指氨基酸序列代表来自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白。嵌合蛋白典型地不是通过氨基酸序列的直接操作产生， 而是从编码该嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达的。在某些实施方案中，例如，本发明的突变型DNA聚合酶的未修饰形式是由来源于栖热菌种DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)区域和来源于Tma DNA聚合酶的羧基末端(C-末端)区域组成的嵌合蛋白。N-末端区域是指从N-末端(氨基酸位置I)延伸到内部氨基酸的区域。类似地，C-末端区域是指从内部氨基酸延伸到C-末端的区域。[0039]在DNA聚合酶的上下文中，与另一条序列(例如区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“对应”是基于根据核苷酸或氨基酸位置数编号并且然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列的规则。因为不是给定的“对应区域”内的所有位置都需要是相同的，对应区域内的非匹配位置可以被认为是“对应位置”。因此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的 “对应于氨基酸位点[X]的氨基酸位置”是指，基于比对，在其它DNA聚合酶和结构同源物和家族中的等效位置。在本发明的一些实施方案中，氨基酸位置的“对应”是根据包含SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39，40或41的一个或多个基序的聚合酶区域来确定的。当聚合酶多肽序列不同于SEQ ID N0S:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39， 40或41 (例如，通过氨基酸的变化或氨基酸的增加或缺失)时，可能与本文所讨论的改进的活性相关的特定突变将不是在与它在SEQ ID N0S:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38， 39，40或41中相同的位置数。例如，在表I中说明了这一点。[0040]如本文使用的，“重组体”是指已经通过重组方法有意识地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”是指通常通过内切核酸酶的核酸操作，最初在体外形成的以自然中通常不存在的形式的核酸。因此，线性形式的分离的突变型DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子体外形成的表达载体都被认为是用于本发明的目的的重组体。可以理解的是，一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞，它将非重组地复制， 即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，这种核酸一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是用于本发明的目的的重组体。“重组蛋白”是使用重组技术，即通过上述重组核酸的表达制备的蛋白。[0041]当被置于与另一种核酸序列的功能性关系时核酸是“可操作连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它是与编码序列可操作连接的；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，那么它是与编码序列可操作连接的。[0042]术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如细菌、酵母和放线菌)以及细胞培养物中生长的来自高等植物或者动物的单个细胞。[0043]术语“载体”指一条DNA，典型是双链的，它可以是其中已经插入了一条外源DNA 的。载体可以 是例如质粒来源的。载体包含在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子” 多核苷酸序列。外源DNA定义为异源的DNA，其是在宿主细胞中天然不存在的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或者编码转基因。载体用于转运外源的或异源的DNA进入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，可以产生数个拷贝的载体及其插入的DNA。另外，载体还可以包含容许插入的DNA转录为mRNA分子或者使插入的DNA复制为多拷贝的RNA的必要元件。 一些表达载体还包括插入的DNA附近的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。[0044]术语“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外，本文中还应当理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其对于使用该核苷酸的特定上下文(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等效的，除非上下文明确另外指明。[0045]术语“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸的聚合物如RNA和DNA，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰的)形式，和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亚单位)。示例性的修饰包括甲基化，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰如不带电的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等)，侧面部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的键(例如α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。虽然合成形式的核酸可以包括其它键(例如，Nielsen等(Science 254:1497权利要求
1.DNA聚合酶，与对照DNA聚合酶相比，所述DNA聚合酶具有增强的3’ -错配辨别力活性，其中对应于SEQ ID NO:1的488位的所述DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸，其中除了对应于SEQ ID NO:1的488位的所述对照DNA聚合酶的氨基酸是S，所述对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。
2.权利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含 A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,其中
或Q; X2是P、T或E; X3是N或H ; X4是L或I ; X5是N或R ; X6是除S以外的任何氨基酸； 父7是1 、？、或3; 父8是0、1(或T ; X9是L或V ; X1。是E、S、A或G ;
X11 是 R、N、Y、T 或 V ; X12是V或I ; X13是F或Y ; 父14是0或E ;以及 父15是￡ 或K (SEQ ID NO:8)。
3.权利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含 A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X1J-X12-L-F-X14-X1S-L,其中 X1是H或E ; X4是L或I ; X6是除S以外的任何氨基酸； X7是R或P ; X8是D或K ; X9是L或V ;
Xltl 是 E 或 S ; X11是R或N; X12是V或I ; 父14是0或E ;以及 父15是￡ 或K (SEQ ID NO:9)。
4.权利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-E-R-V-L-F-D-E-L,其中 X6是除S以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 10)。
5.权利要求
4的0嫩聚合酶，其中乂6是6、八、0、？、1(、(、1'或￥(SEQ ID NO: 11)。
6.权利要求
1-5中任一项的DNA聚合酶，其中对应于SEQID NO:1的580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。
7.权利要求
1-6中任一项的DNA聚合酶，其中对应于SEQID NO:1的580位的氨基酸选自 L、G、T、Q、A、S、N、R 和 K。
8.权利要求
1-7中任一项的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含与SEQID N0:l、2、3、4、5、6、7、36、37、38、39、40或41至少80%，优选至少90%，更优选至少95%序列相同的氨基酸序列。
9.权利要求
6或7中任一项的DNA聚合酶，其中所述聚合酶与SEQID NO:1具有至少 80%,优选至少90%,更优选至少95%的序列同一'丨生。
10.权利要求
9的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是Z05DNA聚合酶，所述580位的氨基酸选自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。
11.重组核酸,其编码权利要求
1-10中任一项的DNA聚合酶。
12.进行引物延伸的方法，包括在适于引物延伸的条件下将权利要求
1-10中任一项的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和三磷酸核苷接触，从而产生延伸的引物。
13.产生延伸的引物的试剂盒，包括至少一个提供权利要求
1-10中任一项的DNA聚合酶的容器。
14.权利要求
13的试剂盒，进一步包括一个或更多个额外的容器，所述容器选自(a)容器，其提供在引物延伸条件下与预定的多核苷酸模板可杂交的引物；(b)容器，其提供三磷酸核苷；以及(c)容器，其提供适合用于引物延伸的缓冲剂。
15.反应混合物，包含权利要求
1-10中任一项的DNA聚合酶，至少一种引物，多核苷酸模板和三磷酸核苷。
专利摘要
公开了相对于对应的未修饰的聚合酶具有增强的3′-错配辨识力的突变型DNA聚合酶。突变型聚合酶可用于多种公开的引物延伸方法中。还公开了相关的组合物，包括可用于，例如，突变型DNA聚合酶生产的重组核酸、载体以及宿主细胞。
文档编号C12N9/12GKCN103003418SQ201180036364
公开日2013年3月27日 申请日期2011年6月17日
发明者F.赖切特, K.鲍尔, T.W.迈尔斯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan