专利名称:合成cDNA的方法
技术领域：
本发明涉及可用于合成cDNA的方法和可用于合成cDNA的试剂盒。
背景技术：
为了阐明生命现象，非常重要的是分析各种基因的mRNA分子。通过RNA依赖性的DNA聚合酶(换而言之,反转录酶)的发现,使得使用RNA作为模板来合成cDNA的反转录反应成为可能，从而在分析mRNA分子的方法中取得显著进步。使用反转录酶来分析mRNA分子的方法，现在已经变成涉及基因的研究中的一种基本实验方法。使用通过反转录反应合成的cDNA作为模板的、用于扩增DNA片段的PCR方法被称作RT-PCR方法。所述RT-PCR方法被用于克隆从mRNA衍生出的cDNA，或用于制造cDNA文库，且也可用作检查特定RNA的表达状态的方法。但是，在用于cDNA合成的样品中污染有DNA的情况下，可能会扩增编码RNA的DNA上的区域或拟基因，因而难以选择性地仅得到使用RNA作为模板合成的DNA。为了抑制由样品中的污染DNA衍生出的扩增产物的生成，采用下述的方法在反转录反应过程中使用核苷酸类似物和会降低Tm值的化合物的方法(专利公开I)，包括使用脱氧核糖核酸内切酶(在下文中，可以称作endoDNase)诸如脱氧核糖核酸酶I (在下文中，可以称作DNA酶I)降解样品中的DNA并在之后进行反转录反应的方法等。
在用DNA酶I降解样品中的DNA后进行反转录反应时，为了抑制cDNA的降解，通常在反转录反应之前通过热处理、苯酚/氯仿萃取等灭活或去除所述DNA酶I。但是，已知的是，苯酚/氯仿萃取是复杂的，且在有二价金属离子(它们是DNA酶I的反应所必需的)存在下的热处理会导致RNA的水解。尽管还提出了 DNA酶I和反转录酶同时起作用的方法(专利公开2和3)，DNA酶I也会降解DNA/RNA杂交物中的DNA，使得以此方式通过反转录反应合成的cDNA遭受DNA酶I的降解。
专利公开
专利公开I: WO 99/09213 专利公开2:日本专利公开号2005-304396 专利公开 3: WO 2006/103039。
发明内容
_6] 本发明要解决的问题
本发明要解决的问题是提供一种合成cDNA的方法，所述方法能够简单地且方便地抑制由样品中的污染DNA衍生出的扩增产物的生成。
解决问题的方式
发明人已经发现，可以制备这样的反应溶液组合物其中endoDNase不表现出活性，且反转录酶表现出活性，且进一步，基于所述发现，已经完成了可以解决上述问题的与合成cDNA的方法和用于合成cDNA的试剂盒有关的本发明。[0008]具体地，本发明涉及
[1]一种合成CDNA的方法，其特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应，
其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA ；
[2]根据[I]所述的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)至(C)
(a)得到组合物，所述组合物包含含有RNA和DNA的样品和脱氧核糖核酸内切酶；
(b)在足以降解所述样品中的DNA的条件下，用脱氧核糖核酸内切酶处理在步骤(a) 中得到的组合物；和
(c)将添加剂和反转录酶加入在步骤(b)中处理过的组合物中，以制备使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并使用反转录酶进行反转录反应；
[3]根据[I]所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸内切酶是脱氧核糖核酸酶I;
[4]根据[I]所述的方法，其中所述反转录酶是从莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反转录酶；
[5]根据[2]所述的方法，其中所述添加剂是选自还原剂、一价阳离子和其盐中的至少一种；
[6]根据[5]所述的方法，其中所述一价阳离子是铵离子；
[7]一种扩增cDNA的方法，所述方法包括下述步骤使用根据在[I]至[6]中任一项所定义的方法合成的cDNA作为模板，进行基因扩增方法；和
[8]一种用于[I]至[7]中任一项所定义的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含(A)脱氧核糖核酸内切酶、(B)缓冲剂、(C)反转录酶和(D)添加剂，其用于制备使所述反转录酶表现出其活性，且使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反转录反应用组合物。
发明效果
根据本发明，使得在可操作性、定量等方面优良的cDNA合成成为可能，该合成能够抑制由样品中的污染DNA衍生出的扩增产物的生成。
图I是显示实施例2中的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
图2是显示实施例8中的实时PCR的结果的图。
具体实施方式
本发明的合成cDNA的方法的特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应，
其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA。
常规地，在包括使用endoDNase降解样品中的DNA然后进行反转录反应的方法中，需要在反转录反应之前，热灭活所述endoDNase或去除所述endoDNase,但是本发明的方法不需要这些操作。换而言之，根据本发明，在用endoDNase降解样品中的DNA和反转录反应之间，不需要进行在60°C或更高温度的热处理或特定组分的分离操作。因此，在本发明的说明书中，短语“热灭活脱氧核糖核酸内切酶(endoDNase) ”表示在60°C或更高温度热处理含有endoDNase的样品，短语“去除脱氧核糖核酸内切酶(endoDNase) ”表示从含有endoDNase的样品中分离endoDNase，短语“不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶”是指不进行上述操作。
虽然不将本发明具体地限于此，但本发明的方法中使用的样品可以是含有RNA的样品，且包括，例如，含有RNA和DNA的样品。具体地，所述样品包括源于活体的样品诸如细胞、组织或血液；借助于众所周知的方法通过处理样品得到的含有核酸的样品；和可能含有生物体的样品，诸如食物、土壤或废水。借助于众所周知的方法通过处理源于活体的样品得到的含有核酸的样品的一个实例包括，例如，从细胞破碎物得到的样品或通过其分级分离得到的样品；富含样品中的总RNA或特定RNA分子的样品，例如，富含mRNA的那些样品，等等，且所述样品可以是污染有DNA的样品。
在本发明的说明书中，脱氧核糖核酸内切酶(endoDNase)是指以内切形式切断 DNA链的酶。可用于本发明中的endoDNase优选地包括双链DNA特异性endoDNase,更优选地包括，例如，序列非特异性内切核酸酶诸如DNA酶I或虾DNA酶，或序列特异性内切核酸酶诸如限制性酶。
所述处理过的样品(其中所述样品中的DNA被endoDNase降解)没有特别限制，只要所述样品保持在使样品中的DNA被endoDNase降解的条件下即可，本领域普通技术人员能够根据endoDNase或样品适当地制备所述样品。尽管没有具体地将本发明限于此，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下,所述保持条件是这样的条件优选地在2(TC至45 保持10秒至12小时，更优选地在25°C至44°C保持30秒至I小时，甚至更优选地在30°C至43°C保持I分钟至30分钟。
可用于本发明中的反转录酶可以是这样的酶其具有反转录活性，换而言之，使用RNA作为模板合成与其互补的DNA的活性，且所述反转录酶包括，例如，从病毒衍生出的反转录酶，诸如从莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反转录酶(MMLV-衍生的反转录酶)和从禽髓母细胞白血病病毒衍生出的反转录酶(AMV-衍生的反转录酶)；从真细菌衍生出的反转录酶，诸如从属于芽孢杆菌属的嗜热细菌衍生出的DNA聚合酶(Bca DNA聚合酶等等)，和从属于栖热菌属的细菌衍生出的具有反转录活性和DNA依赖性的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶等等)。在本发明中，优选地使用从病毒衍生出的反转录酶，且更优选地使用MMLV-衍生的反转录酶。另外，天然存在的酶或重组酶可以在本发明中用作反转录酶，且还可以使用这样的反转录酶在使所述反转录酶具有反转录活性的范围内，对天然存在的氨基酸序列进行修饰。
在本发明的说明书中，短语“使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液”是指“其中所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出DNA降解活性的反应溶液”。所述反应溶液是指，例如，这样的反应溶液甚至当含有40 μ g/mL牛胸腺DNA的反应溶液在有8 U/mL DNA酶I (TAKARA BIO INC.)(在产品上指示的滴度)存在下在25°C保持10分钟时，其在260 nm的吸光度也没有实质性变化。
使endoDNase不表现出其活性的反应溶液含有所述处理过的样品和反转录酶,且可以如下制备例如，在用endoDNase降解样品中的DNA以后，将添加剂、反转录酶和其它组分加入反应溶液中，以制备其中endoDNase不表现出DNA降解活性的组合物。换而言之，包括下述步骤的方法是本发明方法的一个优选实施方案(a)得到包含样品和脱氧核糖核酸内切酶的组合物；(b)在足以降解所述样品中的DNA的条件下，用脱氧核糖核酸内切酶处理在步骤(a)中得到的组合物；和(C)将添加剂和反转录酶加入在步骤(b)中处理过的组合物中，以制备使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应。
优选地，在上述步骤(a)中含有样品和脱氧核糖核酸内切酶的组合物进一步含有缓冲剂诸如Tris-HCl、二价金属离子诸如镁离子或锰离子和还原剂诸如二硫苏糖醇(在下文中，可以称作DTT)。可以在表现出在下一步骤(b)中用endoDNase降解样品中的DNA的活性的范围内，基于酶学性质(诸如e ndoDNase的反应性质或稳定性)或实验来适当地选择缓冲剂、二价金属离子和还原剂的种类或浓度。优选地设定所述种类或浓度，使得endoDNase表现出高活性，并表现出高稳定性。例如，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下，可以设定缓冲剂的种类或浓度，使得其加入会产生endoDNase的接近最佳pH，且能够调节反应溶液的PH至5-10的范围内的种类或浓度是优选的。另外，可以设定还原剂的种类或浓度，使得endoDNase表现出高稳定性；例如，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下，优选地，所述组合物含有浓度为I mM或更高且小于5 mM的DTT。
在上述步骤(b)中足以用脱氧核糖核酸内切酶降解所述样品中的DNA的条件没有特别限制，只要温度和时间的条件是这些的条件在所述条件下降解DNA时，从样品中的DNA衍生出的产物不能实质性地确认,本领域普通技术人员可以根据endoDNase或样品适当地设定条件。尽管没有具体地将本发明限于此，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下，优选地举例在20°C至45°C保持10秒至12小时的条件，更优选地举例在25°C至44°C保持30秒至I小时的条件，甚至更优选地举例在30°C至43°C保持I分钟至30分钟的条件。
在上述步骤(C)中的添加剂包括选自还原剂、一价阳离子和其盐中的至少一种。所述添加剂可以用于本发明中，例如，以含有添加剂的水溶液(优选地含有添加剂的缓冲液)的形式。用于上述缓冲液中的缓冲剂的种类或浓度没有特别限制，只要可以将反应溶液调至希望的pH，通过其加入能够将反应溶液的pH改变至可用于反转录反应中的反转录酶的接近最佳PH的种类或浓度是优选的。尽管没有具体地将本发明限于此，上述缓冲剂包括Good氏缓冲剂诸如Tris-HCl。上述还原剂包括，例如，硫醇还原剂诸如DTT或2-巯基乙醇。另外，上述一价阳离子包括铵离子和碱金属离子诸如钾离子、锂离子和钠离子和其盐，例如，可以使用硫酸铵或氯化钾。使用的还原剂、一价阳离子或其盐的种类或量没有特别限制，只要在添加了添加剂的组合物中所述endoDNase不表现出其活性，且反转录酶有效地起作用即可，本领域普通技术人员能够根据本说明书的公开内容适当地做出决定。尽管没有具体地将本发明限于此，在所述endoDNase是DNA酶I的情况下，在所述组合物(其中所述endoDNase不表现出其活性，且所述反转录酶有效地起作用)中的组分包括例如，硫酸铵、DTT和氯化钾。所述组合物中的硫酸铵的浓度优选地包括5 mM或更高，更优选地包括10-30 mM，甚至更优选地包括14-28 mM。另外，DTT的浓度优选地包括5 mM或更高，更优选地包括11-30 mM，甚至更优选地包括12-20 mM。另外，氯化钾的浓度优选地包括I mM或更高，更优选地包括3-30 mM,甚至更优选地包括5-20 mM。具体地，作为在所述组合物中的终浓度，混合上述添加剂，使得所述组合物优选地含有5 mM或更高的硫酸铵、5 mM或更高的DTT和I mM或更高的氯化钾，更优选地含有10-30 mM硫酸铵、11-30 mM DTT和3_30 mM氯化钾，甚至更优选地含有14-28 mM硫酸铵、11-30 mM DTT和5_20 mM氯化钾，甚至更优选地含有14-28 mM硫酸铵、12-20 mM DTT和5-20 mM氯化钾。
另外，上述添加剂可以以缓冲剂的形式用于制备如下制备的反转录反应溶液混合反转录反应必需的组分，诸如反转录酶、缓冲剂、寡核苷酸引物和dNTP。考虑到操作和反转录酶的稳定性，下述实施方案是优选的所述缓冲液含有除了反转录酶以外的反转录反应必需的组分，且仅仅单独地向其中加入反转录酶。
反转录反应的条件没有特别限制，只要所述条件足以合成与模板RNA互补的引物延伸链。足以合成与模板RNA互补的引物延伸链的条件没有特别限制，温度条件优选地是25°C至60°C，更优选地是30°C至50°C。另外，反应时间优选地是5-120分钟，更优选地是15-60分钟。另外，在反转录反应以后，可以在灭活反转录酶的条件下，温育所述反应溶液。用于灭活反转录酶的条件包括，例如，在85°C持续5秒的条件。本发明的扩增cDNA的方法包括下述步骤使用根据本发明的合成cDNA的方法合成的cDNA作为模板，进行基因扩增反应。在使用cDNA作为模板的核酸扩增中，可以使用本领域众所周知的基因扩增方法，诸如PCR方法、ICAN方法、LAMP方法或SDA方法。例如，在核酸扩增中使用PCR方法的情况下，可以应用一般的PCR条件，所述扩增如下进行例如，通过包括将双链模板DNA解离成单链(变性)，将引物退火至单链模板DNA，和由所述引物合成互补链(延伸)的3个步骤的反应,或通过包括2步反应的反应,其中在上述的3步反应中，在相同温度进行引物的退火和延伸，称作“穿梭PCR” [ uPCR Ho Saizensen (FrontLine of PCR Method), ^(Tanpakushitsu Kakusan Koso (Proteins, Nucleic Acids andEnzymes) ”Supplement, 41 (5)，425-428 (1996)]。作为 PCR 方法，可以使用实时 PCR，其能够用嵌入染料、FRET-标记的探针等等监测核酸扩增。
本发明的试剂盒是用于本发明的合成cDNA的方法或本发明的扩增cDNA的方法中的试剂盒，且所述试剂盒含有(A)脱氧核糖核酸内切酶、⑶缓冲剂、(C)反转录酶和(D)添加剂，其用于制备使所述反转录酶表现出其活性，且使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反转录反应用组合物。上述缓冲剂(B)可以含有endoDNase的反应必需的二价金属离子等等。另外，所述添加剂(D)可以含有使用反转录酶的反转录反应必需的寡核苷酸引物或dNTP。
实施例
在下文中将通过实施例具体地描述本发明，但是无意将本发明的范围限于所述实施例。
实施例I. 用于扣3制EndoDNase活性的反应组成的研究~1
制备了 5种20 μ L反应溶液(反应溶液1-5)，它们含有5 U DNA酶I [重组DNA酶I(无RNA酶)，TAKARA BIO INC. ], 200 ng小鼠基因组DNA和在表I中列出的组分。另外，制备了 5种20 μ L反应溶液，它们具有与上述相同的组成，但是不含有DNA酶I。在这里，将反应溶液I设定为，每种组分的浓度是DNA酶I的标准反应溶液组成的一半，将反应溶液2设定为，具有接近反转录酶的最佳pH的pH，且含有dNTP，所述dNTP用作反转录酶的底物。将这些反应溶液在37°C温育15分钟，然后在85°C温育5秒。接着，根据实时PCR (其中将RsplS基因区域用作靶向序列)，定量在每种反应溶液中剩余的基因组DNA的量。在这里，在实时 PCR 中，使用 SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC·)，并使用下述引物作为引物对由序列表的SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列组成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物。
[表 I]
权利要求
1.一种合成CDNA的方法，其特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应， 其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA。
2.根据权利要求
I所述的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)至(c) (a)得到组合物，所述组合物包含含有RNA和DNA的样品和脱氧核糖核酸内切酶； (b)在足以降解所述样品中的DNA的条件下，用脱氧核糖核酸内切酶处理在步骤(a)中得到的组合物；和 (c)将添加剂和反转录酶加入在步骤(b)中处理过的组合物中，以制备使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并使用反转录酶进行反转录反应。
3.根据权利要求
I所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸内切酶是脱氧核糖核酸酶I。
4.根据权利要求
I所述的方法，其中所述反转录酶是从莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反转录酶。
5.根据权利要求
2所述的方法，其中所述添加剂是选自还原剂、一价阳离子和其盐中的至少一种。
6.根据权利要求
5所述的方法，其中所述一价阳离子是铵离子。
7.一种扩增cDNA的方法，所述方法包括下述步骤使用根据权利要求
1-6中任一项所定义的方法合成的cDNA作为模板，进行基因扩增反应。
8.一种用于权利要求
1-7中任一项所定义的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含下述的(A)至⑶ (A)脱氧核糖核酸内切酶， (B)缓冲剂， (C)反转录酶，和 (D)添加剂，其用于制备使所述反转录酶表现出其活性，且使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反转录反应用组合物。
专利摘要
一种合成cDNA的方法，其特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应，其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA。本发明的用于合成cDNA的方法和试剂盒可广泛地用于基因工程领域。
文档编号C12Q1/68GKCN102884186SQ201180024002
公开日2013年1月16日 申请日期2011年5月9日
发明者中林祐子, 上森隆司, 向井博之, 浅田起代藏 申请人:宝生物工程株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan