产生发酵产物的方法

专利名称：:产生发酵产物的方法
技术领域：
：本发明涉及使用一种或多种发酵生物从植物材料产生发酵产物的方法。发明背景大量难以合成产生的商品如今可通过发酵生物产生。此类产品包括醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1，3_丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、葡糖酸盐/酯、葡糖酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如HjPCO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12,β-胡萝卜素)和激素。发酵亦常用于可消费的醇(例如啤酒和葡萄酒)，奶制品(例如产生酸奶和奶酪方面)，皮革，和烟草工业。本领域中已知大量通过发酵由含淀粉材料的降解提供的糖而产生发酵产物如乙醇的方法。然而，从此类植物材料产生发酵产物如乙醇仍然过于昂贵。因此，存在提供增加发酵产物的收率并由此减少生产成本的方法的需要。本发明的目的是提供改善的产生发酵产物的方法。
发明内容本发明涉及产生发酵产物的方法，其包括用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同工艺产生的发酵量相比产生更多量的发酵产物。本发明亦涉及组合物，其包含(a)GH61多肽，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。发明详述定义α-淀粉酶(0-1，4-葡聚糖-4_葡聚糖水解酶4.(.3.2.I.I)是催化淀粉和其它直链和支化的1，4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。片段术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端具有一个或多个(几个)氨基酸的缺失的多肽；其中所述片段具有酶活性。家族61多肽术语“家族61多肽”意指根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316，及HenrissatΒ·，和BairochΑ·，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases，Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶，EC3.2.I.3)是催化(I—4)-连接的a-D-葡萄糖残基从链的非还原端连续水解并释放β-D-葡萄糖的酶。分离的术语“分离的”和“纯化的”意指从预期天然结合的至少一种组分分离的多肽或多核苷酸。举例而言，变体如SDS-PAGE确定，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如琼脂糖电泳确定，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。成熟多肽术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后的最终形式的多肽。亲本酶术语“亲本”意指接受改变以产生变体的酶。亲本可为天然存在的(野生型)的多肽或其变体。序列同一性参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277),优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一I"生(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一丨生百分比，并计算如下(同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)变体术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指邻接占据某位置的氨基酸添加1-5个氨基酸。野生型酶术语“野生型”酶意指由天然存在的微生物如在自然界发现的细菌、酵母或丝状真菌表达的酶。自未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法本发明涉及从未经糊化(常称作“未经烹制”)的含淀粉材料产生发酵产物的方法。在一个实施方案中，该方法包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖原生成酶(糖化酶)的存在下对(例如经磨制的)含淀粉材料糖化以产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成发酵产物，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的发酵量相比产生更多量的发酵产物。因此，本发明的该方面涉及产生发酵产物的方法，其包括用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖。[0028]术语“起始糊化温度”意指淀粉发生糊化的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在50°C至75°C开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定品种以及生长条件而改变。给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein和Lii,1992，StarchZStcirkei44(12):461-466描述的方法5%的淀粉颗粒丧失双折射的温度。本发明的方法可进一步包括例如通过蒸馏回收所述发酵产物。所述发酵产物可为浆料，如可制备粒状淀粉，其具有10_55被％含淀粉材料的干固体(DS)，优选25-45wt%干固体，更优选30-40wt%干固体。浆料可包含水分和/或工艺水(processwater),例如爸懼物(逆流(backset))、洗漆水(scrubberwater)、蒸发器冷凝液或懼出物、来自蒸懼的侧线汽提器水(side-stripperwater)或来自其它发酵产物设备(Plant)的工艺水。由于该工艺在糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增力口，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含I至70vol%，优选15-60vol%，特别为30至50vol%包含水分和/或工艺水，例如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubberwater)、蒸发器冷凝液或懼出物、来自蒸懼的侧线汽提器水或来自其它发酵产物设备的工艺水，或其组合等。可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到O.05至3.Omm,优选O.I至O.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的方法后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少87%，至少88%,至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%的淀粉转化为可溶的淀粉水解物。本发明该方面的方法在低于起始糊化温度的温度进行。例如，在24-40°C范围的温度，如25-40°C，29-35°C，30-34°C，如32°C左右。本领域技术人员可容易地确定合适的工艺条件。本发明的方法可在3至7的pH，例如3.5至6或4至5的pH进行。在一个实施方案中，进行该方法从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6wt%以下，3wt%以下，2wt%以下，lwt%以下，0.5wt%以下或O.25wt%以下，或O.lwt%以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领域技术人员可方便地确定使用的发酵生物和酶的剂量/量。发酵生物和酶的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为O.5wt%以下，如O.2wt%以下。含淀粉材料在本发明的方法中，可使用任何合适的含淀粉的起始材料。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明工艺的含淀粉的起始材料的实例包括大麦、豆(bean)、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆(pea)、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦、和全谷粒，或它们的组合。所述含淀粉材料亦可为蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。发酵产物术语“发酵产物”意指包括使用发酵生物发酵的方法生成的产物。根据本发明所包括的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，HjPCO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、Β12、β-胡萝卜素)；以及激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用的中性酒)；或工业乙醇或用于可饮用醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦芽酒(maltliquors)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcoholbeer)、低醇啤酒(low-alcoholbeer)、低热量啤酒(low-caloriebeer)或清淡啤酒(lightbeer)。发酵牛物术语“发酵生物”指适于产生所需发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物如丝状真菌。根据本发明合适的发酵生物能够将可发酵的糖，如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖和/或木糖直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，特别是树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)，特别是阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、博伊丁氏假丝酵母(Candidaboidinii)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、Candidasonorensis，热带假丝酵母(Candidatropicalis)或产朊假丝酵母(Candidautilis)的菌株。其它发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)的菌株；克鲁维酵母(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)的菌株；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的菌株。优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是掠榈发酵细菌(Zymobactorpalmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BGlLl(AppI.Microbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacterethanolicus)、Thermoanaerobactermathrani或热角军糖热厌氧杆菌(ThermoanaerobacterthermosaccharoIyticum)的菌株。还想到的是乳杆菌属(Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌R(CorynebacteriumglutamicumR)，热葡糖苷酶芽抱杆菌(Bacillusthermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽抱杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。在一个实施方案中，所述发酵生物是C6糖发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基中活的发酵生物如酵母计数为IO5至1012，优选IO7至101°的范围内，特别是约5xl07。对于乙醇发酵，酵母是优选的发酵生物。优选酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌种的菌株,优选对高水平的乙醇，即高至例如10，12，15或20vol%或更高的乙醇具有抗性的菌株。商业上可获得的酵母包括，例如LNFSA1,LNFBGI，LNFPE2和LNFCATI(可从LNFfcazil获得)，REDSTAR和ETHANOLRED酵母(可从Fermentis/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann’sYeast,USA获得)，SUPERSTART和THERM0SACC新鲜酵母(可从EthanolTechnology,WI,USA获得)，BIOFERMAFT和XR(可从NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA获得),GERTSTRAND(可从GertStrandAB,Sweden获得)和FERMI0L(可从DSMSpecialties获得)。根据本发明，能够从可发酵的糖产生所需的发酵产物的发酵生物优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入/添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可视为适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经过一段最大生长的时间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，此时活细胞数减少。遞发酵条件基于例如，植物材料的种类、可用的可发酵糖类、发酵生物和/或期望的发酵产物来确定。本领域技术人员可容易地确定合适的发酵条件。根据本发明的发酵可在通常使用的条件下进行。优选的发酵方法为厌氧方法。举例而言，发酵可在高至75°C的温度，例如40_70°C，如50_60°C进行。然而，具有显著较低至室温左右(20°C左右)的最适温度的细菌也是已知的。合适的发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。对于使用酵母的乙醇产生，发酵可进行24至96小时，特别是35至60小时。在一个实施方案中，发酵在20至40°C，优选26至34°C，特别是32°C左右的温度进行。在一个实施方案中，PH为3至6，优选为pH4至5左右。其它发酵产物可在本领域技术人员已知适于所讨论的发酵生物的温度进行发酵。发酵通常在3至7范围的pH，优选在pH3.5至6，如pH5左右进行。发酵通常持续6-96小时。本发明的方法可作为分批或连续过程进行。发酵可在超滤系统中进行，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。同样涵盖的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法/工艺，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。在发酵后，发酵生物可自发酵浆料分离并再循环。发酵培养基发酵培养基("Fermentationmedia〃或"fermentationmedium")指其中进行发酵的环境，并包括发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源。发酵培养基可包含对于发酵生物的其它营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；维生素和矿物质，或其组合。回收在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏发酵培养基以提取所需发酵产物，或可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取所需发酵产物。或者，发酵产物可通过汽提来回收。回收的方法在本领域是公知的。塵下述酶在本发明的方法中应以“有效量”使用。GH61多狀在本发明的方法中，可使用任何GH61多肽。在一个方面，所述GH61多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)包含上述所示的基序的GH61多肽可进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],其中X为任意氨基酸，X(l,2)为在I个位置或2个连续位置的任意氨基酸，X(3)为3个连续位置的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置的任意氨基酸。在一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)在另一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二个方面，所述GH61多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4，5)—G—x—Y—[ILMV]—x—R—x—[EQ]-χ(3)~Α~[HNQ]，其中χ为任意氨基酸，χ(4，5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而χ(3)为3个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。在第三个方面，所述GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:I(土生梭孢霉)，SEQIDNO:2(土生梭孢霉)，SEQIDNO:3(土生梭孢霉)，SEQIDNO:4(土生梭孢霉)，SEQIDNO:5(土生梭孢霉)，SEQIDNO:6(土生梭孢霉)，SEQIDΝ0:7(桔澄嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)),SEQIDN0:8(里氏木霉)，SEQIDNO:9(嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)),SEQIDNO:10(嗜热毁丝霉)，SEQIDNO:11(嗜热毁丝霉)，SEQIDNO:12(嗜热毁丝霉)，SEQIDNO:13(嗜热毁丝霉)，SEQIDNO:14(桔橙嗜热子囊菌)，SEQIDNO:15(烟曲霉)，SEQIDNO:16(嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)),SEQIDNO:17(嗜热子囊菌属菌种(Thermoascussp.)),SEQIDN0:18(青霉属菌种(Penicilliumsp.)),SEQIDNO:19(土生梭孢霉)，SEQIDNO:20(土生梭孢霉)，SEQIDNO:21(土生梭孢霉)，SEQIDNO:22(土生梭孢霉)，SEQIDNO:23(土生梭孢霉)，SEQIDNO:24(土生梭孢霉)，SEQIDNO:25(土生梭孢霉)，SEQIDNO:26(土生梭孢霉)，SEQIDNO:27(土生梭孢霉)，SEQIDNO:28(土生梭孢霉)，SEQIDNO:29(土生梭孢霉)，SEQIDNO:30(甲壳嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)),SEQIDN0:31(甲壳嗜热子囊菌)，SEQIDN0:32(甲壳嗜热子囊菌)的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性程度。在第六个方面，所述GH61多肽人工变体，所述人工变体包含SEQIDNO:I,SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9,SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20，SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDN0:31，或SEQIDNO:32的成熟多肽；或其同源序列的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。优选地,氨基酸改变对性质是较不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为I至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或结合域(bindingdomain)。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适PH等。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的纤维素分解增强活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一'丨生分析来推断，所述多肽与亲本多肽相关。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffIing)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；W095/17413;或冊95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、曬菌体展不(例如，Lowman等，1991，Biochemistry.30:10832-10837；美国专利No.5，223，409；W092/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定多肽中单个氨基酸残基的重要性。SEQIDNO:I,SEQIDN0:2,SEQIDN0:3,SEQIDNO:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15,SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20，SEQIDNO:21，SEQIDNO:22，SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30,SEQIDNO:31，或SEQIDNO:32的成熟GH61多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过4，例如1、2、3或4。在一个方面，所述GH61多肽在WO2008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。在一个方面，所述GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物或含硫化合物的存在下使用。所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3，4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二酚；联苯三酚；没食子酸；甲基_3，4，5-三羟基苯甲酸；2，3，4-三羟基二苯甲酮；2，6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5-二羟基苯甲酸；4_氯-1，2-苯二酚；4_硝基-1，2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2_丁炔-1，4-二醇；克酮酸；1，3-丙二醇；酒石酸；2，4-戊二醇；3-乙氧基-1，2-丙二醇；2，4，4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1，4-二醇；3，4-二羟基-3-环丁烯-1，2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acroleinacetal);甲基_4_羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3，5-二甲氧基-4-轻基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色銲离子(flavyliumion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin);槲皮素(quercetin);杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin);山奈酌·(kaempferol);桑素(morin);金合欢素(acacetin);柚皮素(naringenin);异鼠李黄素(isorhamnetin);疗菜苷配基(apigenin);花青素(cyanidin);花色素苷(cyanin);kuromanin;花青素鼠李葡糖苷(keracyanin);或它们的盐或溶剂合物。[0091]所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-批唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫却基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并11惡唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异Π引哚基、Π丫唳基、苯并异B,惡唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、口引噪基、二氮杂草基(diazepinyl)、氮杂草基(azepinyl)、硫杂草基(thiepinyl)、哌唳基和噁庚基(oxepinyl)。在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1，2-二羟乙基)-3，4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5_羟基-2(5H)_呋喃酮；[1，2_二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-Y-丁内酯；核糖酸Y-内酯；己醛糖酸Y-内酯(aldohexuronicaldohexuronicacidY-lactone);葡糖酸δ-内酯；4_轻基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(fuiOin);2(5!1)-呋喃酮；5，6-二氢-2!1-吡喃-2-酮；和5，6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2_氨基苯酚；1，2-苯二胺；2，2，6，6-四甲基-I-吡啶基氧(piperidinyloxy);5，6，7，8-四氢生物蝶呤;6，7-二甲基-5，6，7，8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1，4-苯醌；1，4-萘醌；2_羟基-1，4-萘醌；2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌或辅酶Qtl;2，3，5，6-四甲基-1，4-苯醌或四甲基对苯醌；1，4-二羟基蒽醌；3-羟基-I-甲基-5，6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌；批咯并喹啉醌(pyrroloquinolinequinone);或它们的盐或溶剂合物。所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide),磺酸和磺酸酯的模块。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2_丙硫醇；2_丙烯-I-硫醇；2_巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1，2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。在一个实施方案中，所述GH61多肽以2-1000微克/g干固形物(DS)，例如5-100，10-40或20-40微克/gDS的量存在。α-淀粉酶根据本发明，可使用任何α-淀粉酶，如真菌、细菌或植物来源的α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加时在3至7，优选3.5至6，或更优选4_5的范围内的PH具有最佳活性的α-淀粉酶(EC3.2.I.I)。细菌α-淀粉酶用于本发明的α-淀粉酶可为细菌α-淀粉酶，例如来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis),嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophiIus)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的菌株,但也可来源于其它芽孢杆菌属菌种。α-淀粉酶的特定实例包括WO99/19467的SEQIDNO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，WO99/19467的SEQIDΝ0:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO99/19467的SEQIDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于W099/19467的SEQIDN0S:3、4或5中的任何序列具有至少60%，例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。·所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO96/23873、WO96/23874,WO97/41213,WO99/19467,WO00/60059和WO02/10355(所有文件通过提述并入本文)中描述的变体和/或杂合体。具体α-淀粉酶变体公开于美国专利号6，093，562、6，187，576或美国专利号6，297，038(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO96/23873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1_10行(通过提述并入本文)，优选与WO99/19467公开的SEQIDN0:3所列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于Λ(181-182)，或使用WO99/19467中的SEQIDNO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO99/19467公开的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Λ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌杂合体α-淀粉酶所述α-淀粉酶可为杂合体α-淀粉酶，例如，包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于TO1999/19467的SEQIDNO:4)的445个C-末端氨基酸残基，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO:5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部的α-淀粉酶G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQIDNO:4中地衣芽孢杆菌编号方式)。也优选具有一个或多个下述突变的变体(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶中的对应突变)Η154Υ，Α181Τ，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选Ε178和G179的缺失(关于编号方式，使用WO99/19467的SEQIDΝ0:5)。在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每gDS(干固体)，优选O.001-1KNU每gDS,如大约O.050KNU每gDS的量剂量添加。真菌α-淀粉酶真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如川地曲霉(Aspergilluskawachii)，黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)α-淀粉酶。优选的酸性真菌α-淀粉酶为下述的α-淀粉酶，其与WO96/23874的SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%,至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶是黑曲霉α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO89/01969(实施例3，其通过提述并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S，Denmark得到)。其它野生型α-淀粉酶包括源自多孔菌属(Meripilus)和根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，优选巨多孔菌(Meripilusgiganteus)或微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178，其通过提述并入本文)的菌株的那些α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉(Kaneko等1996，J.Ferment.Bioeng.81:292-298“Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablea-amylasefromAspergilluskawachii，，，并进一步为EMBL:#AB008370)。所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α_淀粉酶催化域的野生型酶或其变体。真菌杂合体α-淀粉酶在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的实例包括WO2005/003311或美国专利申请公开号2005/0054071(Novozymes)和WO2006/069290(Novozymes)中公开的那些，所述文件通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域(SBD)，以及任选的接头。杂合体α-淀粉酶的实例包括WO2006/069290实施例中的表I到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的变体(W02006/069290中的SEQIDNO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(TO2006/069290中的SEQIDNO:101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQIDNO:20,SEQIDN0:72和SEQIDN0:96的组合公开于表5)，或W02006/069290中表5中作为V039的α-淀粉酶，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(W02006/069290中的SEQIDNO:102)ο其它杂合体α-淀粉酶列于美国申请号11/316，535和冊2006/069290(其通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中。杂合体α-淀粉酶的其它实例包括美国专利申请公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。其它α-淀粉酶与任何上面提及的α-淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上述公开的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%,至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性。[0117]酸性α-淀粉酶可根据本发明以O.001至10AFAU/gDS，例如O.01至5AFAU/gDS,特别是O.3至2AFAU/gDS,或O.001至lFAU-F/gDS,优选O.01至lFAU-F/gDS的量添加。商业性α-淀粉酶产品优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASE(DSM)，BAN,TERMAMYLSC，FUNGAMYL,LIQU0ZYMEX，LIQU0ZYMESC和SANSUPER,SANEXTRAL(NovozymesA/S)和CLARASEL-40,000，DEX-LO,SPEZYMEFRED,SPEZYMEAA,SPEZYMEDELTAAA,GC358,GC980,以及SPEZYMERSL(DaniscoA/S)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从NovozymesA/S,Denmark获得)。糖源生成酶(糖化酶)术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(均为麦芽糖生成者)以及α-葡糖苷酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本发明的产生发酵产物如乙醇的方法时。所产生的碳水化合物可直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。混合物包括包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(即AGU每FAU-F)可为O.I至100AGU/FAU-F，特别是2至50AGU/FAU-F，如10-40AGU/FAU-F的范围。葡糖淀粉酶所述葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBOJ.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO92/00381,WO00/04136和WO01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶,米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等，1991，Agric.Biol.Chem.，55(4):941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体G137A和G139A(Chen等，1996,Prot.Eng.9:499-505);D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等，1997，ProteinEng.10:1199-1204)。其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4，727,026和Nagasaka等，1998,ApplMicrobiolBiotechnol.50:323-330),踩节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自杜邦踩节菌(Talaromycesduponti)、埃莫森踩节菌(Talaromycesemersonii)(W099/28448)、TalaromycesIeycettanus(美国专利号Re.32,153)、嗜热踩节菌(Talaromycesthermophilus)(美国专利号4，587,215)。细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium),特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(W086/01831)，均在WO2006/069289中公开的瓣环栓菌(Trametescingulata)、纸质大纹饰抱菌(Pachykytosporapapyracea)和大白桩(Leucopaxillusgiganteus),PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。杂合体葡糖淀粉酶可用于本发明。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例在WO2005/045018中公开。具体实例包括实施例I的表I和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。所述葡糖淀粉酶，可与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高序列同一性程度，S卩，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L；AMG300L；SANSUPER,SANEXTRAL,SPIRIZYMEPLUS,SPIRIZYMEtmFUEL，SPIRIZYMEB4U,SPIRIZYMEULTRA和AMGE(来自NovozymesA/S,Denmark)；0PTIDEX300，GC480和GC147(来自GenencorInt.,USA);AMIGASE和AMIGASEPLUS(来自DSM)；G-ZYMEG900，G-ZYME和G990ZR(来自GenencorInt.)。所述葡糖淀粉酶可以以0.02_20AGU/gDS，优选O.1-lOAGU/gDS，特别是在O.l-5AGU/gDSjBO.l-2AGU/gDSjnO.5AGU/gDS的量，或以O.0001_20AGU/gDS，优选O.001-10AGU/gDS，特别是0.01_5AGU/gDS,$n0.l_2AGU/gDS的量添加。β-淀粉酶“β-淀粉酶”(E.C3.2.I.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1，4-α-葡糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β_淀粉酶的名称。已经从多种植物和微生物中分离了β_淀粉酶(Fogarty和KelIy,1979,ProgressinIndustrialMicrobiology,15，112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40°C到65°C的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自NovozymesA/S,Denmark的N0V0ZYMWBA和来自GenencorInt.，USA的SPEZYMEBBA1500。产麦芽糖淀粉酶淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，Ε.C.3.2.I.133)，其催化将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由NovozymesA/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利号4，598，048，4，604,355和6，162，628，其通过提述并入本文。所述产麦芽糖淀粉酶可以O.05-5mg总蛋白/克DS或O.05-5MANU/gDS的量添加。肌醇六磷酸酶任何肌醇六磷酸酶可用于本发明的方法。肌醇六磷酸酶是通过特异性水解肌醇和磷之间的酯键而降解肌醇六磷酸盐和/或肌醇六磷酸的酶。肌醇六磷酸酶活性取决于许多成分中磷和离子的可获得性。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶能够从肌醇六磷酸(例如植酸)释放至少一个无机磷酸。肌醇六磷酸酶可根据其对于植酸分子上起始水解处的磷酸酯基团的具体位置的偏好进行分组(例如3-肌醇六磷酸酶(EC3.I.3.8)或6-肌醇六磷酸酶(EC3.I.3.26))。肌醇六磷酸酶的实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶(myo_inositol-hexakiphosphate-3-phosphohydrolase)。肌醇六磷酸酶可从微生物如真菌或细菌生物获得。举例而言，所述肌醇TK憐Ife酶可从丝状真囷如曲霉属(例如无花果曲霉(A.ficuum)，烟曲霉，黑曲霉和土曲霉(A.terreus))，支胞属(Cladospirum),毛霉属(Mucor)(例如梨形毛霉(Mucorpiriformis)),毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophila)),青霉属(例如p.hordei(ATCCNo.22053)，桧状青霉(P.piceum)(ATCCNo.10519)，或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCCNo.48944)),踩节菌属(Talaromyces)(例如嗜热踩节菌(T.thermophilus)),嗜热霉属(Thermomyces)(WO99/49740)和木霉属菌种(Trichodermaspp.)(例如里氏木霉(T.reesei))获得。在一个实施方案中，所述肌醇六磷酸降解酶从酵母(例如Arxulaadeninivorans、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、西方许望酵母(Schwanniomycesoccidentalis)),革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌、克雷伯氏菌属菌种(Klebsiellaspp.)、假单胞菌属菌种(Pseudomonasspp.)),和革兰氏阳性细菌(例如芽孢杆菌属菌种如枯草芽孢杆菌)获得。所述肌醇六磷酸酶亦可从朽1檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Bnterbacter)或隔孢伏革菌属(Peniophora)获得。在一个实施方案中，所述肌醇六磷酸酶来源于布丘氏菌属菌种(ButtiauxielIaspp.)如乡间布丘氏菌(B.agrestis)、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。在一些实施方案中，所述肌醇六憐酸酶是WO2006/043178或美国申请号11/714,487中公开的肌醇六磷酸酶。在一个优选实施方案中，所述肌醇六磷酸酶与美国申请号No.12/263，886的SEQIDNO:31中所示的氨基酸序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少88%，至少90%，至少93%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%和至少99%的序列同一性。商业上可获得的肌醇六磷酸酶为NATUPHOS(BASF)，R0N0ZYMEP(NovozymesA/S),PHZYME(DaniscoA/S,Diversa)和FINASE(ABEnzymes)。用于确定微生物肌醇六憐酸酶活性的方法和肌醇六磷酸酶单位的定义公开于Engelen等，1994，JournalofAOACInternational77:760-764。所述肌醇六磷酸酶可为野生型肌醇六磷酸酶，其活性变体或活性片段。普鲁兰酶任何普鲁兰酶可用于本发明的方法。在一个实施方案中，所述普鲁兰酶为GH57普鲁兰酶，例如从热球菌属(Thermococcus)，包括热球菌属菌种AM4，热球菌属菌种HJ21,Thermococcusbarophilus,Thermococcusgammatolerans,Thermococcushydrothermalis；Thermococcuskodakarensis,Thermococcuslitoralis；和Thermococcusonnurineus的菌株；或从火球菌属(Pyrococcus),如深海火球菌(Pyrococcusabyssi)和激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的菌株获得的普鲁兰酶。蛋白酶蛋白酶可在糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中添加。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其它蛋白酶。合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在PH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。酸性真菌蛋白酶可来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、奉巴齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。具体而言，所述蛋白酶可来源于棘孢曲霉(WO95/02044)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964,Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)或米曲霉,如pepA蛋白酶，以及来自米黑毛霉(Mucormiehei)和微小毛霉(Mucorpusillus)的酸性蛋白酶。所述蛋白酶可为中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。所述蛋白酶可与在Swissprot作为登录号P06832公开的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别是至少99%同一性。所述蛋白酶可与WO2003/048353中作为SEQIDNO:I公开的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%同一性。所述蛋白酶可为选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝蘑蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(称猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。在Iv实施方案中，所述蛋白酶来源于曲霉属，如米曲霉的囷株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的菌株。在另一个实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，HandbookofProteolyticEnzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编，AcademicPress,SanDiego,1998,270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括，例如，Berka等，1990，Gene96:313;Berka等，1993,Genel25:195-198;以及Gomi等，1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100中公开的那些，其通过提述并入本文。所述蛋白酶亦可为金属蛋白酶，其定义为选自下组的蛋白酶(a)属于EC3.4.24(金属内肽酶)；优选EC3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶；(b)上述手册中属于M组的金属蛋白酶；(c)尚未分配至宗族(clan)(命名宗族MX)，或属于宗族MA，MB,MC,MD，ME,MF,MG，MH之一(如上述手册第989-991页定义)的金属蛋白酶；(d)其它家族的金属蛋白酶(如上述手册第1448-1452页定义)；(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；[0161](f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；(g)属于家族10，]26，]/127，]/02，]/04，]/05，]/06，]/141，]/143，或147之一(如上述手册第1448-1452页定义)的金属蛋白酶；(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；和(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如上述手册第1492-1495页定义)。在其它具体实施方案中，金属蛋白酶是其中对肽键的亲核攻击通过由二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰离子。所述金属离子的位置可由氨基酸配体固定。配体的数量可为五个、四个、三个、两个、一个或零个。在一个具体实施方案中，该数量为两个或三个，优选三个。对于本发明的方法中使用的金属蛋白酶的来源并无限制。在一个实施方案中，该金属蛋白酶归类为EC3.4.24，优选EC3.4.24.39。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶是酸稳定性金属蛋白酶，例如真菌酸稳定性金属蛋白酶，如来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的金属蛋白酶(归类为EC3.4.24.39)。在另Iv实施方案中，所述金属蛋白酶来源于曲霉属的囷株，优选米曲霉的囷株。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶与WO2010/008841的SEQIDN0:1(桔橙嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至177，-159至177，或优选氨基酸I至177具有至少80%，至少82%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少97%的序列同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方案中，所述金属蛋白酶由与上面提及的SEQIDN0:1具有同一性程度的氨基酸序列组成。所述桔橙嗜热子囊菌金属蛋白酶是适用于本发明的方法的金属蛋白酶的优选实例。另一种金属蛋白酶来源于米曲霉，并包含WO2003/048353中公开的SEQIDN0:11的序列，或其氨基酸-23-353「23-374「23-397；1-353；1-374；1-397；177-353;177-374;或177-397，和WO2003/048353中公开的SEQIDNO:IO0另一种适用于本发明的方法的金属蛋白酶是包含WO2010/008841的SEQIDNO:5的米曲霉金属蛋白酶，或下述金属蛋白酶其为分离的多肽，与SEQIDNO:5具有至少80%，至少82%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少97%的同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方案中，所述金属蛋白酶组成为SEQIDN0:5的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，金属蛋白酶具有与桔橙嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个、或十五个氨基酸的氨基酸序列。在另一个实施方案中，金属蛋白酶具有与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差十个、九个、八个、七个、六个或五个氨基酸，例如四个、三个、两个或一个氨基酸的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述金属蛋白酶a)包含如下或b)由如下组成i)W02010/008841的SEQIDNO:I的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177的氨基酸序列；ii)W02010/008841的SEQIDNO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的氨基酸序列；[0175]iii)WO2010/008841的SEQIDNO:5的氨基酸序列；或i)，ii)，和iii)的序列具有蛋白酶活性的等位变体或片段。WO2010/008841的SEQIDNO:I的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177，或WO2010/008841的SEQIDNO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的片段是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，片段含有至少75个氨基酸残基，或至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述金属蛋白酶与另一种蛋白酶如真菌蛋白酶,优选酸性真菌蛋白酶组合。商业上可得到的产品包括ALCALASE,ESPERASE,FLAV0URZYME,NEUTRASE,RENNILASE，N0V0ZYMFM2.0L,以及iZymeBA(可从NovozymesA/·S，Denmark获得)和GC106和来自GenencorInternational,Inc.，USA的SPEZYMEFAN。所述蛋白酶可以以O.OOOl-Img酶蛋白每克DS，优选O.001到O.Img酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以O.0001到lLAPU/gDS，优选O.001至IJO.lLAPU/gDS和/或O.0001到ImAU-RH/gDS，优选O.001到O.ImAU-RH/gDS的量存在。组合物在该方面，本发明涉及组合物，其包含(a)GH61多肽，(b)葡糖淀粉酶和(C)α-淀粉酶。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种其它糖酶，如α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶。所述组合物可包含一种或多种糖源生成酶，如特别是葡糖淀粉酶，β-淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，普鲁兰酶，α-葡糖苷酶或其组合。在另一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种GH61多肽和一种或多种发酵生物如酵母和/或细菌。发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。用途本发明亦涉及GH61多肽在发酵方法中的用途。在一个实施方案中，GH61多肽用于改善发酵产物收率。修饰的发酵生物本发明亦涉及用编码GH61多肽的多核苷酸转化的修饰的发酵生物，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达所述GH61多肽。在一个优选实施方案中，所述发酵生物是微生物，如酵母或丝状真菌，或细菌。其它发酵生物的实例可见于“发酵生物”部分。发酵生物可用编码GH61多肽的基因使用本领域公知的技术进行转化。本文中描述并要求保护的发明不限于本文中公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。意图将任何等同的实施方案包括在本发明的范围内。事实上，根据前文的描述，除了本文中说明和记载的修饰之外对本发明的各种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。意欲使这些修饰也落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包含定义的本公开为准。此处引用了多篇参考文献，将它们整体通过提述并入。材料和方法葡糖淀粉酶活性(AGU)葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测量。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37°C，pH4.3，底物23.2mM麦芽糖，缓冲液乙酸盐O.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解I微摩尔麦芽糖的酶量。可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何a-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。权利要求1.一种产生发酵产物的方法，其包括用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用糖化酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的发酵量相比产生更多量的发酵产物。2.—种产生发酵产物的方法，其包括用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用糖化酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在GH61多肽的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖，其中所述GH61多肽存在的量导致与不具有所述GH61多肽的相同方法产生的二糖的量相比产生更少量的二糖。3.权利要求I或2的方法，其中所述糖化酶是β-淀粉酶、葡糖淀粉酶或产麦芽糖淀粉酶。4.权利要求1-3任一项的方法，其在普鲁兰酶和/或异淀粉酶的存在下进行。5.权利要求1-4任一项的方法，其在蛋白酶的存在下进行。6.权利要求1-5任一项的方法，其在20-40°C的温度进行。7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述含淀粉材料选自下组大麦、豆、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦、和全谷粒，或它们的任意混合物。8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母。9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1，3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、乳酸、琥珀酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2),以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12,β-胡萝卜素)和激素。10.权利要求9的方法，其中所述发酵产物是乙醇。11.权利要求1-10任一项的方法,进一步包括回收所述发酵产物。12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述GH61多肽(a)与任何SEQIDNOS:1-32具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,或至少99%序列同一性；或(b)是任何SEQIDN0S:1-32具有GH61多肽活性的片段。13.权利要求1-11任一项的方法，其中所述GH61多妝是Aurantiporusalborubescens的。14.一种组合物，其包含(a)GH61多肽，(b)葡糖淀粉酶和(C)淀粉酶。15.权利要求14的组合物，其进一步包含普鲁兰酶。16.权利要求14或15的组合物，其中所述GH61多肽(a)与任何SEQIDNOS:1-32具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,或至少99%序列同一性；或(b)是任何SEQIDN0S:1-32具有GH61多肽活性的片段。17.权利要求14或15的组合物，其中所述GH61多妝是Aurantiporusalborubescens的。。专利摘要本发明涉及产生发酵产物的方法，其包括用α-淀粉酶在GH61多肽的存在下将含淀粉材料液化为糊精；用葡糖淀粉酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物发酵所述糖。文档编号C12N9/28GKCN102918160SQ201180026899公开日2013年2月6日申请日期2011年3月30日发明者宋子良,J.桑德斯申请人:诺维信北美公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan