生产发酵产物的方法

专利名称：:生产发酵产物的方法
技术领域：
：本发明涉及从糊化和/或未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法。技术背景从含淀粉材料产生发酵产物(如乙醇)，在本领域是众所周知的。一般而言使用两种不同的方法。最常使用的方法，通常称作“常规方法”，包括在高温使用(一般地)细菌α-淀粉酶液化经糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时糖化和发酵。另一种众所周知的方法，通常称作“生淀粉水解(rawstarchhydrolysis)”方法(RSH方法)，包括在初始糊化温度以下同时液化和发酵粒状淀粉，一般而言，该方法是在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶存在下进行的。美国专利5，231，017-Α公开了在乙醇发酵过程中使用酸性真菌蛋白酶，所述方法包括用α-淀粉酶液化经糊化的淀粉。WO2003/0668公开了对未烹制的醪液(non-cookedmash)进行生淀粉水解方法(RSH方法)，所述方法是在真菌葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和真菌蛋白酶存在下进行的。WO2007/145912公开了产生乙醇的方法，其包括将包含从植物材料获得的粒状淀粉的浆料与α-淀粉酶接触5分钟到M小时，所述α-淀粉酶能够在ρΗ3.5到7.0且在淀粉糊化温度以下的温度溶解粒状淀粉；获得包含多于20%葡萄糖的底物，并在发酵生物和淀粉水解酶存在下，在10°C-40°C的温度发酵所述底物10小时到250小时。其它在接触步骤中添加的酶可包括蛋白酶。WO2006/028897公开了液化含淀粉材料的方法，其包括用支链淀粉酶(pullulanase)在40°C_60°C的温度将经α-淀粉酶处理的淀粉处理20到90分钟。仍期望和需要提供改进的方法，以供从含淀粉材料产生发酵产物，如乙醇。
发明内容本发明涉及从经糊化以及未糊化的含淀粉材料使用发酵产物产生发酵产物(如乙醇)的方法。在第一个方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括使用糖源生成酶和发酵生物在所述含淀粉材料起始糊化温度以下的温度在金属蛋白酶(metelloprotease)的存在下同时糖化和发酵含淀粉材料。在第二个方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤(a)在α-淀粉酶存在下将含淀粉材料液化；(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；(c)使用发酵生物进行发酵；其中金属蛋白酶在i)发酵过程中，和/或ii)液化之前、过程中和/或之后存在。在第三个方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤(a)在α-淀粉酶存在下液化含淀粉材料；(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；(c)使用发酵生物进行发酵；其中金属蛋白酶在i)发酵过程中和/或ii)液化之前、过程中和/或之后存在，而且支链淀粉酶在i)发酵过程中和/或ii)液化之前、过程中和/或之后存在。本发明还涉及包含金属蛋白酶、糖源生成酶和α-淀粉酶的组合物，和包含金属蛋白酶和支链淀粉酶，和/或糖源生成酶和/或α-淀粉酶的组合物。最后本发明涉及金属蛋白酶在将糊化和/或未糊化的含淀粉材料发酵为发酵产物的方法中的用途，或金属蛋白酶和支链淀粉酶在将经糊化的含淀粉材料发酵为发酵产物的方法中的用途。发明详述本发明涉及从经糊化以及未糊化的含淀粉材料使用发酵生物产生发酵产物(如乙醇)的方法。本发明人发现，当在生淀粉水解方法(RSH方法)中使用来源于桔橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)CGMCCNo.0670的金属蛋白酶或来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的金属蛋白酶时，与在相应的方法中未添加金属蛋白酶时或添加选自其它蛋白酶组的蛋白酶时相比，发酵速率提高，且乙醇得率增加。此外，本发明人发现当将来源于桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的金属蛋白酶添加至常规乙醇方法时，乙醇得率得到改进。令人惊讶的是，将所述金属蛋白酶以及来源于沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)的热稳定性支链淀粉酶添加至常规乙醇方法与单独添加所述金属蛋白酶或支链淀粉酶相比，乙醇得率提高，表明其对乙醇得率有协同作用。金属蛋白酶如本文所使用的术语“蛋白酶”定义为水解肽键的酶。其包括任何属于EC3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的酶。EC编号指来自NC-IUBMB，AcademicPress,SanDiego,California的酶命名法(EnzymeNomenclature)1992，包括分别发表于Eur.J.Biochem.1994,223,1-5；Eur.J.Biochem.1995,232,1-6；Eur.J.Biochem.1996,237,1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；以及Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增补1-5。该命名法定期增补并更新；参见,例如，互联网站点www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index,html。蛋白酶基于其催化机理归类为下列组丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知的或尚未分类的蛋白酶(U)，参见HandbookofProteolyticEnzymes(S),A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编)，AcademicPress(1998)，特别是一般介绍部分。如本文所使用的术语“金属蛋白酶”定义为选自下组的蛋白酶(a)属于EC3.4.24(金属内肽酶(metalloendop印tidase))的蛋白酶；优选为EC3.4.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶；(b)属于上述手册中M组的蛋白酶；(c)尚未指定族群(clan)(命名族群MX)，或属于族群MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中任一的金属蛋白酶(如上述手册中第989-991页所定义的)；[0031](d)其它家族的金属蛋白酶(如上述手册中第1448-1452页所定义的)；(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；(g)属于家族M3、]/C6、M27、M32、M;M、M;35、M36、M41、M43或M47中任一的金属蛋白酶(如上述手册中第1448-1452页所定义的)；(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；和(i)属于M35家族的金属蛋白酶(如上述手册中第1448-1452页所定义的)。在其它特定实施方案中，金属蛋白酶是如下的水解酶，其中对肽键的亲核攻击由水分子介导，该水分子由二价金属阳离子激活。二价阳离子的实例为锌、钴或锰。所述金属离子可由氨基酸配体保持在适当的位置(heldinplace)。配体的数目可为五、四、三、二、一或零。在一个特定实施方案中，所述数目是二或三，优选为三。为了确定一个给出的蛋白酶是否为金属蛋白酶，可参照上述手册以及其中标明的原则。可对所有种类的蛋白酶进行上述确定，无论其为天然存在的或野生型蛋白酶，或者遗传工程改造的(geneticallyengineered)或合成的蛋白酶。蛋白酶活性可使用任何合适的测定法来测定，其中使用底物，所述底物包含与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。PH测定法和温度测定法同样地适用于所述蛋白酶。pH值测定法的实例为pH6、7、8、9、10或11。温度测定法的实例为30、35、37、40、45、50、55、60、65、70或80°C。蛋白酶底物的实例包括酪蛋白，如天青精交联的(Azurine-crosslinked)酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。两种蛋白酶测定法描述于下面“材料和方法”部分，其中所谓AZCL-酪蛋白测定法是优选方法。对于用于本发明方法中的金属蛋白酶的来源没有任何限制。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶归类为EC3.4.24，优选EC3.4.24.39.在一个实施方案中，本发明使用的金属蛋白酶是酸稳定金属蛋白酶，更优选为真菌酸稳定金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的金属蛋白酶(归类为EC3.4.24.39)。在另一个实施方案中，所述金属蛋白酶来源于曲霉属(Aspergillus)的菌株，优选米曲霉的菌株。所述金属蛋白酶不仅包括天然或野生型金属蛋白酶，还包括其显示金属蛋白酶活性的任何突变体、变体、片段等，以及合成的金属蛋白酶，如经改组的(shuffled)金属蛋白酶，以及共有的(consensus)金属蛋白酶。如本领域公知的，可制备经遗传工程改造的金属蛋白酶，例如，通过定位诱变，通过PCR(使用包含期望突变的PCR片段作为PCR反应的一个引物)，或通过随机诱变进行。共有的蛋白质的制备描述于，例如，EP897，985。如本文中与给定来源相连使用的术语“从...获得”应意指核酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由存在来自所述来源的核酸序列的细胞产生。在一个优选实施方案中，所述多肽是胞外分泌的(secretextracellularly)。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶是包含如下氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与本文中SEQIDN0:1的氨基酸-178到177、-159到177，或优选与氨基酸1到177(成熟多肽)具有至少约80%、或至少约82%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约97%的同一性程度；且其具有金属蛋白酶活性(下文称为“同源多肽”)。在特定实施方案中，所述金属蛋白酶由与SEQIDNO:1具有如上所述的同一性程度的氨基酸序列组成。所述桔橙嗜热子囊菌金属蛋白酶，其成熟多肽包含本文中SEQIDNO:1的氨基酸1-177，是适用于本发明方法的金属蛋白酶的优选实例。另一个同源多肽来源于米曲霉，并包含本文中的SEQIDNO:3(和公开于W02003/048353的SEQIDNO:11)，或其氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397，并由本文中的SEQIDNO2和公开于WO2003/048353的SEQIDNO10编码。另一个适用于本发明方法的金属蛋白酶是包含本文中SEQIDNO:5的米曲霉金属蛋白酶。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶是包含如下氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与本文中SEQIDNO5具有至少约80%、或至少约82%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约97%的同一性程度；且其具有金属蛋白酶活性(下文称为“同源多肽”)。在特定实施方案中，所述金属蛋白酶由与SEQIDNO:5具有如上所述的同一性程度的氨基酸序列组成。在一个特定实施方案中，同源多肽具有与本文中SEQIDNO=I的氨基酸_178到177、-159到177或+1到177，或本文中SEQIDNO:5相差四十、三十五、三十、二十五、二十或十五个氨基酸的氨基酸序列。在另一个实施方案中，同源多肽具有与本文中SEQIDNO:1的氨基酸-178到177、-159到177或+1到177，或本文中SEQIDNO5相差十、或九、或八、或七、或六、或五个氨基酸的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中，同源多肽具有与本文中SEQIDNO1的氨基酸-178到177、-159到177或+1到177，或本文中SEQIDNO:5相差四、或三、或二、或一个氨基酸的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，所述金属蛋白酶a)包含，b)由如下组成i)本文中SEQIDNO1的氨基酸-178到177,-159到177或+1到177的氨基酸序列；ii)本文中SEQIDNO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23_397、1-353、1_374、1-397、177-353、177-374或177-397的氨基酸序列；iii)本文中SEQIDNO5的氨基酸序列；或者i)、ii)或iii)的序列的等位变体、或片段，其具有蛋白酶活性。本文中SEQIDNO1氨基酸-178到177、-159到177或+1到177或者本文中SEQIDNO3氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的片段是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，片段包含至少75个氨基酸残基，或至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。等位变体指占据相同染色体位点的基因两个或更多个可选形式(alternativeform)。等位变体天然地通过突变出现，且可导致种群内的多态性(polymorphism)。基因突变可为沉默的(silent)(在编码的多肽中无变化)，或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因等位变体编码的多肽。在另一个实施方案中，所述金属蛋白酶与其它蛋白酶(如真菌蛋白酶，优选为酸性真菌蛋白酶)组合。从未糊化的含淀粉材料产牛发酵产物的方法在此方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物，而无含淀粉材料的糊化(即，无烹制)的方法。根据本发明，可产生期望的发酵产物，如乙醇，而不液化含有含淀粉材料和水的含水浆料。在一个实施方案中，本发明的方法包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下对(例如，经磨制的)含淀粉材料，例如粒状淀粉进行糖化以产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成期望的发酵产物。在该实施方案中，期望的发酵产物(优选乙醇)从未糊化的(即，未烹制的)，优选经磨制的谷类谷粒(如玉米(corn))产生。相应地，在第一个方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括使用糖源生成酶和发酵生物在所述含淀粉材料起始糊化温度以下的温度在金属蛋白酶(metelloprotease)的存在下同时糖化和发酵含淀粉材料。所述发酵产物(如特别是乙醇)，可任选地在发酵后回收(例如，通过蒸馏进行)。合适的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。一般而言，淀粉酶，如葡糖淀粉酶和/或其它糖源生成酶，和/或α-淀粉酶，存在于发酵过程中。葡糖淀粉酶和其它糖源生成酶的实例可见于下文，且包括生淀粉水解葡糖淀粉酶(rawstarchhydrolysingglucoamylase)0α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶，优选酸性真菌α_淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母，优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株。其它合适的合适的发酵生物列于上面“发酵生物”部分。术语“起始糊化温度”意指淀粉糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50°C_75°C开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人员确定。因而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定变种以及生长条件而改变。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein.S.和Lii.C.,Starch/Starke,Vol.44(12)pp.461-466(1992)描述的方法5%的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在起始本方法之前，可制备含淀粉材料，如粒状淀粉的浆料，其具有10-55W/W-%含淀粉材料的干固体(DS)，优选25-45W/W-%干固体，更优选30-40W/W-%干固体。浆料可包含水分和/或工艺水(processwater)，例如釜馏物(逆流)、洗涤水、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripperwater)或来自其它发酵产物设备的工艺水。由于本发明的方法在起始糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70Vol-%，优选15-60VOl-%，特别是约30至50VOl-%的水分和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水或来自其它发酵产物设备的工艺水，或其组合等。可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm,优选0.1-0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的方法后，含淀粉材料中至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或者优选至少99%的干固体转化为可溶的淀粉水解物。本发明此方面的方法在起始糊化温度以下的温度进行，其意指所述温度通常在30-750C，优选45-60°C的范围内。在一个优选实施方案中，本方法在25-40V，如28-35V，如30V-34V，优选约32°C的温度进行。在一个实施方案中，进行本方法从而使得糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如6w/w%以下，如约3w/w%以下，如约2w/w%以下，如约lw/w%以下，如约0.5%以下，或0.25W/W%以下，如约0.lw/wW以下。上述低水平的糖可通过简单地使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领域技术人员可方便地确定使用的酶和发酵生物的剂量/量。酶和发酵生物所用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约0.5w/w%以下，如约0.2w/w%以下。本发明的方法可在pH约3-7，优选pH3.5至6，或更优选pH4至5进行。在一个实施方案中，发酵进行6到120小时，特别是M到96小时。自经糊化的含淀粉材料中产牛发酵产物的方法在此方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物(特别是乙醇)的方法，所述方法包括液化步骤，以及顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤(a)在α-淀粉酶存在下液化含淀粉材料；(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；(c)使用发酵生物进行发酵；其中金属蛋白酶在i)发酵过程中和/或ii)液化之前、过程中和/或之后存在。本发明还涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤(a)在α-淀粉酶存在下液化含淀粉材料；(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；(c)使用发酵生物进行发酵；其中金属蛋白酶在i)发酵过程中，和/或ii)液化之前、过程中和/或之后存在，且支链淀粉酶在i)发酵过程中，和/或ii)液化之前、过程中和/或之后存在。糖化步骤(b)和发酵步骤(C)可顺序或同时进行。当所述方法作为顺序糖化和发酵方法进行时，所述金属蛋白酶可在糖化和/或发酵过程中添加，而当步骤(b)和(C)同时进行时(SSF方法)，所述金属蛋白酶可在发酵之前或过程中添加。所述金属蛋白酶还可方便地在液化之前添加(前液化处理)，即，在步骤(a)之前或过程中添加，和/或在液化之后添加(后液化处理)，即，在步骤(a)之后添加。所述支链淀粉酶最有利地在液化之前或过程中添加，即，在步骤(a)之前或过程中添加。所述发酵产物(如特别是乙醇)，可任选地在发酵后回收(例如，通过蒸馏进行)。合适的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。液化优选在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶或酸性真菌α-淀粉酶存在的条件下进行。所述发酵生物优选是酵母，优选酿酒酵母的菌株。合适的发酵生物列于上面“发酵生物”部分。在特定实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前还包括下述步骤[0087]χ)减小含淀粉材料的粒度，优选通过磨制(milling)；y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。含水浆料可含有10-55/^-%含淀粉材料的干固体(此)，优选25-45/^-%的干固体(DS)，更优选30-40W/W-%干固体。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶，优选细菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(稀化(thinning))。在一个实施方案中，在进行步骤(a)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使其糊化。在一个实施方案中，液化可作为三步热浆方法来进行。将浆料加热至60-95°C，优选80-85°C，并添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可将浆料在95-140°C，优选105-125°C的温度喷射蒸煮约1-15分钟，优选约3_10分钟，特别是约5分钟左右。使浆料冷却至60_95°C并添加更多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化方法通常在ρΗ4.0-6.5，特别是在ρΗ4.5-6进行。糖化步骤(b)可使用本领域众所周知的条件进行。举例而言，完全的糖化方法可持续约M至约72小时，然而，通常仅在30-65°C，通常约60°C的温度进行通常40-90分钟的预糖化，然后是在同时发酵和糖化方法(SSF方法)中在发酵过程中的完全糖化。糖化通常在20-75°C，优选40-70°C，通常约60°C的温度，在ρΗ4-5的pH，通常在约ρΗ4.5进行。发酵产物，特别是乙醇生产中最广泛使用的方法为同时糖化和发酵(SSF)方法。其中对糖化没有保持阶段，意思是发酵生物(如酵母)和酶(包括金属蛋白酶)可一起添加。SSF可通常在25°C至40°C，如沘°C至;35°C，如30V至；34°C，优选约32°C左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵进行6到120小时，特别是M到96小时。发酵培养基“发酵培养基”指进行发酵的环境，其包括发酵底物，S卩，由发酵生物代谢的糖源。所述发酵培养基可包含营养物(nutrient)和针对所述发酵生物的生长刺激剂(growthstimulator)。营养物和生长刺激剂在发酵领域广泛应用，并包括氮源(如氨)；尿素，维生素和矿物质，或其组合。发酵生物术语“发酵生物”指任何适用于发酵方法并能够产生所期望的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物。特别合适的发酵生物能够将糖(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括SI^M^ft(Saccharomycesspp.),(Saccharomycescerevisiae)的胃株。在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中，从而使得活的(viable)发酵生物(如酵母)在每mL发酵培养基中的计数，在IO5到1012，优选IO7到101Q，特别是约5xl07的范围内。商业上可得到的酵母包括，例如，REDSTAR和ETHAN0LRED酵母(可由Fermentis/Lesaffre,USA得到)，FALI(可由Fleischmann，sYeast,USA得到)，SUPERSTARI^PTHERM0SACC新鲜酵母(可由EthanoljTechnologyjLUSA得到)，BI0FERMAFT禾ΠXR(可由NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA得到)，GERTSTRAND(可由GertStrandAB，Sweden得到)，以及FERMI0L(可由DSMSpecialties得到)。[0100]含淀粉材料根据本发明，可使用任何合适的含淀粉的材料。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明方法的含淀粉的材料的实例包括全谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆、大豆或甘薯，或其组合，或由其获得的淀粉，或谷类。也涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。术语“粒状淀粉”意指未烹制的生淀粉，S卩，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒中的淀粉。淀粉在植物细胞中作为不溶于水的微小颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50°c-75°c的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉质量，优选至少90%，至少95%，至少97%或至少99.5%纯，或其可为更加粗制的含淀粉材料，其含有包括非淀粉部分(如胚残余物和纤维)的(例如，经磨制的)全谷粒。原材料(如全谷粒)可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两个方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并常常用于使用淀粉水解物产生(例如)糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的，并等同地涵盖于本发明的方法中。在一个实施方案中，粒度减少至约0.05到3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更优选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0.05到3.Omm筛网，优选0.1到0.5mm筛网的筛。发酵产物术语“发酵产物”意指使用发酵生物通过包括发酵步骤的方法生成的产物。根据本发明所涵盖的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇和丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸和葡萄糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，吐和0)2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶类；维生素(例如，核黄素、B12和β-胡萝卜素)；以及激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒；或工业乙醇或在可消费醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcoholbeer)、{氐醇啤酒(low-alcoholbeer)(low-caloriebeer)^ifitP^S(Iightbeer)。Mffi的优选发酵方法包括醇发酵方法。根据本发明所得的发酵产物，如乙醇，可优选用作燃料。然而，如果其为乙醇，其亦可用作饮用乙醇。Ml^在发酵之后，可从发酵培养基中分离发酵产物。可蒸馏浆料以提取期望的发酵产物，或可从发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取期望的发酵产物。或者，可通过提馏(stripping)回收发酵产物。回收技术在本领域为众所周知的。酶即使在本发明的方法的上下文中未特别提及，可理解的是酶为以“有效量”使用。α-淀粉酶根据本发明可使用任何α-淀粉酶(如真菌、细菌或植物来源的)。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(Ε.C.3.2.1.1)，当其以有效量添加时，在3到7，优选3.5到6，或更优选4-5的范围内的ρΗ具有最佳活性。细菌α-淀粉酶根据本发明，所述细菌α-淀粉酶优选源自芽孢杆菌属。在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis),角军淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),枯草杆菌(Bacillussubtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的菌株，但也可源自其它芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的特定实例包括示于W099/19467的SEQIDNO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO99/19467的SEQIDNO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO99/19467的SEQIDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO99/19467的SEQIDNOS1，2或3中的任何序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%，更优选至少90%，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10；355(所有文件通过提述并入本文)任一中所描述的。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6，093，562、6，297,038或美国专利号6，187，576(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO1996/023873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO99/19467公开的SEQIDNO3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO99/19467中的SEQIDNO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其较之WO99/19467公开的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌杂合α-淀粉酶特别涵盖的杂合α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基(示于WO99/19467的SEQIDNO:4)，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基(示于WO99/19467的SEQIDNO:5)，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQIDNO4的地衣芽孢杆菌编号)。也优选具有一个或更多下述突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)的变体Η1ΜΥ，Α181Τ，N190F,A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选Ε178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQIDΝ0:5编号)。在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每gDS，优选0.001-1KNU每gDS，例如约0.050KNU每gDS的量添加。[0119]真菌α-淀粉酶真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)，M曲霉(Aspergillusniger)禾口川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fimgamyl-样α-淀粉酶，其源自米曲霉的菌株。根据本发明，术语“Fimgamyl-样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即与W096/23874的SEQIDNO10所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶来自黑曲霉，作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO89/01969(实施例3，通过提述并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP^8(可由NovozymesA/S，Denmark得到)。其它涵盖的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(lihizomucor)和亚灰树花菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178通过提述并入本文)或大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)菌株的那些α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等J.Ferment.Bioeng.81:292-298(1996)“Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stableα-amylasefromAspergilluskawachii.”公开，并进一步作为EMBL:#AB008370公开。所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。真菌杂合α-淀粉酶在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括公开于WO2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(Novozymes)或美国专利申请号60/638，614(Novozymes)中的那些，通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可包括α-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。所涵盖的杂合α-淀粉酶的特定实例包括美国专利申请号60/638，614实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD(US60/638，614中的SEQIDNO:100)的Fungamyl变体，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD(US60/638,614中的SEQIDNO101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316，535中氨基酸序列SEQIDNO20,SEQIDNO72和SEQIDNO96的组合公开于表5)，或作为W02006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(US60/638，614中的SEQIDNO102)。其它特别涵盖的杂合α-淀粉酶为任何列于美国申请号11/316，535和WO2006/069290实施例4中表3、4、5、6中所列的任何杂合α-淀粉酶(通过提述并入本文)。涵盖的杂合α-淀粉酶的其它特定实例包括美国专利公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。也涵盖下述α-淀粉酶，其与任何上面提及的α-淀粉酶显示高同一性，g卩，与成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性。酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.001到10AFAU/gDS，优选0.01到5AFAU/gDS,特别为0.3到2AFAU/gDS或0.001到lFAU-F/gDS，优选0.01到lFAU-F/gDS的量添加。商业α-淀粉酶产品优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM(GistBrocades)的MYC0LASE；BANTM、TERMAMYLSC、FUNGAMYL、LIQU0ZYMEX、LIQUOZYMESC禾ΠSANSUPER、SANEXTRAL(NovozymesA/S)和CLARASEL-40,000、DEX-LO、SPEZYME、FRED、SPEZYMEAA和SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt.),FUELZYME-LF(VereniumInc)，以及以商品名出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。糖源生成酶术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生成者)以及支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本方面的方法以供产生发酵产物，例如乙醇时。所产生的碳水化合物可直接或间接的转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。葡糖淀粉酶活性(AGU)和真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)间的比例(S卩，A⑶每FAU-F)可在本发明的一个优选实施方案中为1-100AGU/FAU-F，特别是2-50AGU/FAU-F，如在10-40AGU/FAU-F范围内，特别是当进行一步发酵(生淀粉水解-RSH)时，即，当糖化和发酵同时进行(即，不经液化步骤)时。在一个常规淀粉到乙醇的方法中(即，包括液化步骤(a))，所述比例可优选定义于EP140，410-B1，特别是当步骤(b)中的糖化和步骤(c)中的发酵同时进行时。葡糖淀粉酶根据本发明使用的葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)，EMBOJ.3(5)p.1097-1102)，或其变体，如公开于WO92/00381,WO00/04136和WO01/04273(来自Novozymes，Denmark)的那些；公开于WO84/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，(1991)，55(4)p.941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强热稳定性的变体:G137A和G139A(Chen等，(1996)，Prot.Eng.9，p.499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，(1995)，Prot.Eng.8，p.575-582)；N182(Chen等，(1994)，Biochem.J.301，ρ·275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，(1996),Biochemistry,35,p.8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等，(1997)，ProteinEng.10，p.1199-1204)。[0139]其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4，727，0和Nagasaka等(1998)"Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticiumrolfsii,ApplMicrobiolBiotechnol50:323-330),碟节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromycesemersonii)(WO99/28448)、TalaromycesIeycettanus(美国专利号Re.32，153)，杜邦踝节菌(Talaromycesduponti),嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)(美国专禾丨J号4，587，215)的。涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135，138)禾口热it化S梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)以及瓣环栓菌(Trametescingulata)，纸质大纹饰孢菌(Pachykytosporapapyracea)，以及大白桩菇(Leucopaxillusgiganteus)的葡糖淀粉酶，其均披露于WO2006/069289；或W02007/1M^5中公开的红边隔孢伏革菌(Peniphorarufomarginata)，或其混合物。根据本发明涵盖的还有杂合葡糖淀粉酶。所述杂合葡糖淀粉酶的实例公开于WO2005/045018。特定的实例包括实施例1表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。涵盖的还有葡糖淀粉酶，即与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L、AMG300L.SANSUPER、SANEXTRAL、SPIRIZYMEPLUS、SPIRIZYMEtmFUEL、SPIRIZYMEB4U、SPIRIZYMEULTRA和AMGE(来自NovozymesA/S)；0PTIDEX300、GC480、GC417(来自GenencorInt.)；AMIGASE和AMIGASEPLUS(来自DSM)；G-ZYMEG900、G_ZYME和G990ZR(来自GenencorInt.)。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶以0.0001_20AGU/gDS，优选0.OOl-lOAGU/gDS,特别是0.01-5AGU/gDS，如0.l_2AGU/gDS的量添加。g-淀粉酶β-淀粉酶(Ε.C3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉，支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1，4-α_糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构型，由此得到淀粉酶的名称。已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.Μ.Fogarty和C.T.Kelly，ProgressinIndustrialMicrobiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40°C到65°C的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自NovozymesA/S，Denmark的N0V0ZYMWBA和来自GenencorInt.，USA的SPEZYMEBBA1500。产麦芽糖淀粉酶淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α_麦芽糖水解酶，Ε.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由NovozymesA/S得到。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4，598，048，4，604，355和6，162，628，其通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/gDS的量添加。支链淀粉酶支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖水解酶)，是以其水解(例如)支链淀粉(amylopectin)和支链淀粉(pullulan)中的α-1，6_葡糖苷键的能力为特征的脱支酶(debranchingenzyme)。本发明特别涵盖的支链淀粉酶包括来自美国专利号4，560，651(通过提述并入本文)中公开的Bacillusamyloderamificans的支链淀粉酶、WO01/151620中作为SEQIDNO2公开的支链淀粉酶(通过提述并入本文)、W001/151620中作为SEQIDNO4公开的Bacillusderamificans(通过提述并入本文)，和来自WO01/151620中作为SEQIDNO:6公开的Bacillusacidopullulyticus的支链淀粉酶(通过引入并入本文)，其还描述于FEMSMic.Let.(1994)115,97-106。其它本发明涵盖的支链淀粉酶包括来自沃氏火球菌的支链淀粉酶，特别是来自W092/(^614公开的沃氏火球菌DSMNo.3773，以及在本文中作为SEQIDNO:6公开的成熟蛋白质序列。可以根据本发明以有效量加入支链淀粉酶，所述有效量包括约0.OOOl-IOmg酶蛋白每克DS，优选0.0001-0.IOmg酶蛋白每克DS，更优选0.0001-0.OlOmg酶蛋白每克DS的优选量。支链淀粉酶活性可作为NPUN确定。确定NPUN的测定法描述于下面的“材料和方法”部分。商业上可得到的合适的支链淀粉酶产品包括PR0M0ZYMED，PR0M0ZYMED2(NovozymesA/S，Denmark)、OPTIMAXL-300(Genencorlnt.,USA)禾口AMANO8(Amano,Japan)。包含金)白或金)白Sl禾口支铺的組合夺勿根据此方面，本发明涉及包含金属蛋白酶和糖源生成酶以及α-淀粉酶(优选葡糖淀粉酶)，和/或酸性α-淀粉酶的组合物，或包含金属蛋白酶和支链淀粉酶，和/或糖源生成酶和/或α-淀粉酶的组合物。所述金属蛋白酶可为任何金属蛋白酶，包括上面“金属蛋白酶”部分所列的那些。在一个优选实施方案中，所述金属蛋白酶归类为EC3.4.24，更优选EC3.4.24.39.在一个优选实施方案中，所述金属蛋白酶来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的菌株，或同源金属蛋白酶，其与SEQIDNO=I具有至少约80%、或至少约82%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约97%的同一性。所述糖源生成酶可为任何糖源生成酶，包括上面“糖源生成酶”部分所列的那些。在一个优选实施方案中，所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述葡糖淀粉酶选自源自如下菌株的组曲霉属，优选黑曲霉或泡盛曲霉的菌株，踝节菌属，特别是埃莫森踝节菌的菌株；或阿太菌属(Athelia)，特别是罗耳阿太菌的菌株；栓菌属(Trametes)，优选瓣环栓菌的菌株；大纹饰孢菌属(Pachykytospora)的菌株，优选(Pachykytosporapapyracea)Wliftt；SIftSM(Leucopaxillus),优选大白桩菇的菌株；或隔孢伏革菌属(Peniophora)的菌株，优选菌种红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)^liitt；所述α-淀粉酶可为任何α-淀粉酶，包括在上面“α_淀粉酶”部分提及的那些。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，特别是酸性真菌α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶选自真菌α-淀粉酶的组。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自曲霉属，特别为黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉或川地曲霉的菌株，或根毛霉属，优选微小根毛霉的菌株，或亚灰树花菌属，优选大型亚灰树花菌的菌株，或芽孢杆菌属，优选嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。所述支链淀粉酶可为任何支链淀粉酶，包括“支链淀粉酶”部分提及的那些。在一个实施方案中，所述支链淀粉酶是来源于火球菌属(Pyrococcus)(优选沃氏火球菌菌株)的热稳定性支链淀粉酶。所述组合物可配制为使得金属蛋白酶可合适地以对应于0.OOOl-IOmg酶蛋白每克DS，优选0.OOOl-Img酶蛋白每克DS，更优选0.0001-0.OlOmg酶蛋白每克DS的量用于一种方法(优选本发明的方法)。葡糖淀粉酶，当存在时，可以以0.0001-20AGU每gDS的量使用。酸性α-淀粉酶，当存在时，可以以0.001到IFAU-F每gDS的量使用。支链淀粉酶，当存在时，可以以约0.OOOl-IOmg酶蛋白每克DS，优选0.0001-0.OlOmg酶蛋白每克DS的量使用。在本发明一个优选实施方案中，葡糖淀粉酶活性(AGU)和真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(S卩，A⑶每FAU-F)可为0.1-100AGU/FAU-F，特别是2-50AGU/FAU-F，如在10-40AGU的范围内，而葡萄淀粉酶和酸性α-淀粉酶之间的比例在0.3-5.0AFAU/AGU的范围内。本发明的上述组合物适用于产生本发明发酵产物(如乙醇)的方法。用途本发明还涉及使用金属蛋白酶从经糊化和未糊化的含淀粉材料产生发酵产物，并涉及使用金属蛋白酶和支链淀粉酶从经糊化的含淀粉材料产生发酵产物。本文中所描述和要求保护的发明不限于本文中所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的数个方面。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。事实上，根据前述说明，除本文所显示和描述的之外，本发明的各种修改形式对于本领域技术人员是显而易见的。此类修改也意欲落入所附权利要求的范围内。若有冲突，以包括定义的本公开为准。对本发明更加详细地在下述实施例中进行描述，所述实施例是用于说明本发明，但决非意欲限定本发明要求保护的范围。本文中引用的所有参考文献均通过提述其中描述的内容具体地并入。材料和方法材料葡糖淀粉酶A(AMGA):ff02006/069289的SEQIDNO:2中公开的源自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶，并可自NovozymesA/S得到。葡糖淀粉酶B(AMGB):ff002/028448的SEQIDNO:7中公开的源自埃默森踝节菌的葡糖淀粉酶，并可自NovozymesA/S得到。α-淀粉酶A(AAA):ff02006/069290的表5中作为V039公开的杂合α-淀粉酶，由微小根毛霉α-淀粉酶与黑曲霉葡糖淀粉酶的接头和SBD组成(NovozymesA/S)。α-淀粉酶B(AAB):ff099/019467中作为SEQIDNO3公开的源自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶,具有I181+G182双缺失和N193F取代，可自NovozymesA/S得到。α-淀粉酶Z(AAZ):Richardson等(2002)，TheJournalofBiologicalChemistry，Vol.277，No29，Issue19July,pp.26501-26507中公开的α-淀粉酶，称作BD5088。该α-淀粉酶与本文中SEQIDNO:4所示淀粉酶的相同。成熟酶序列从起始的位置1“Met”氨基酸之后开始。所述酶可从Verenium得到。金属蛋白酶A(MPA)作为本文中SEQIDNO1的氨基酸1-177和W02003/048353中SEQIDNO:2的氨基酸1-177公开的金属蛋白酶，来自桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。金属蛋白酶B(MPB)作为TO9628542中的SEQIDNO:2公开的源自米曲霉的氨基肽酶1。酶序列的成熟部分从W096^542的SEQIDNO2中氨基酸残基80起始，且所述酶的成熟部分作为SEQIDNO5在本文中公开。支链淀粉酶A(PUA):ff092/02614中公开的源自沃氏火球菌DSMNo.3773的支链淀粉酶。成熟蛋白质序列是本文中SEQIDNO6的氨基酸1-1095。酵母REDSTAR，可得自RedMar/Lesaffre，USA。方法同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，两个氨基酸序列间的同一性程度，以及两个核苷酸序列间的同一性程度，可通过“比对(align)”程序来确定，所述程序为Needleman-Wimsch比对(S卩，全局比对)。所述程序用于多肽，以及核苷酸序列的比对。对多肽比对使用缺省计分矩阵BL0SUM50，而对核苷酸比对使用缺省的同一性矩阵。缺口第一个残基的罚分为-12(对于多肽)和-16(对于核苷酸)。缺口其它残基的罚分为-2(对于多肽)和-4(对于核苷酸)。“比对”是FASTA程序包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS852444-2448，禾口W.R.Pearson(1990)“RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA,“MethodsinEnzymology183:63-98)。FASTA蛋白质比对使用对缺口大小无限制的Smith-Waterman算法(参见〃Smith-Watermanalgorithm",Τ.F.Smith和Μ.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)。蛋白质测定法AZCL-酪蛋白测定法将0.2%蓝色底物AZCL-酪蛋白溶液搅拌悬于硼砂/NaH2PO4缓冲液pH9中。一边搅拌一边将所述溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶试样，然后将板在Eppendorf热混合器中在45°C和600rpm温育30分钟。使用变性的酶试样(100°C沸腾20分钟)作为空白。在温育后，通过将微滴定板转移至冰上而终止反应，且通过在4°C以3000rpm离心5分钟来分离有色溶液与固体。将60μL上清转移至微滴定板，并使用BioRad微板读数器测定在595nm的吸光度。[0187]DNA测定法将50μL含蛋白酶的试样添加至微滴定板，并通过添加100μLImMρΝΑ底物(5mg溶于100μLDMS0,并进一步用硼砂/NaH2PO4缓冲液pH9.0稀释至IOmL)来起始所述测定法。监测0D405在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。葡糖淀粉酶活性(A(iU)葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测定。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37°C，pH4.3，底物麦芽糖23.2mM，缓冲液乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。AMG温育底物麦芽糖23.2mM缓冲液乙酸盐0.1MpH:4.30士0.05温育温度37V士1反应时间5分钟酶工作范围0.5-4.0AGU/mL颜色反应GlucDH:430U/L变旋酶9U/LNAD:0.21mM缓沖液磷酸盐0.12M;0.15MNaClpH:7.60士0.05温育温度37°C士1反应时间5分钟波长340nm更详细描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据要求由NovozymesA/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。α-淀粉酶活性(KNU)α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackishblue)，但在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，>|f其禾口有色玻璃标准(coloredglassstandard)进亍比较。一个千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37°C+/"0.05；0.0003MCa2+;以及pH5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质MerckAmylumSolubile所需的酶量。更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可根据要求由NovozymesA/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。[0200]酸性旦二瀘捡酶活性(AEAU)[0201]当根据本发明使用时，酸性。一淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌。一淀粉酶单位)测定。或者，酸性。一淀粉酶的活性可以以AAU(酸性。一淀粉酶单位)测定。[0202]酸性旦二瀘捡酶里位(丛U)[0203]酸性。一淀粉酶活性可以AAU(酸性。一淀粉酶单位)测定，其为绝对方法。一个酸性淀粉酶活性(AAU)为在标准化条件下每小时将lg淀粉(100％干物质)转化为下述产物的酶量，所述产物在与已知浓度的碘溶液反应后在620nm的透射与颜色参照之一相同。[0204]拯進叁住上反座叁住[0205]底物可溶性淀粉，浓度约20gDS／L[0206]缓沖液柠檬酸盐，约o．13M，pH一4．2[0207]碘溶液40．1．76g碘化钾+o．088g碘／L[0208]自来水15’一20’dH(德国硬度)[0209]DH4．2[0210]温育温度30℃[0211]反应时间11分钟[0212]波长620rlm[0213]酶浓度o．13一o．19AAU／mL[0214]酶的工作范围o．13一o．19AAU／mL[0215]所述淀粉应为Litner淀粉。其为在实验室中用作比色指示剂的稀糊淀粉。Litner通过用稀盐酸处理天然淀粉而得到，因而其保留与碘变蓝色的能力。进一步的细节可见于EP0140，41082，其通过提述并入本文。[0216]确定FAU—F[0217]FAU—F真菌。一淀粉酶单位(Fungamyl)相对于已知强度的酶标准物进行测量。权利要求1.一种从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括使用糖源生成酶和发酵生物在所述含淀粉材料起始糊化温度的温度以下在金属蛋白酶的存在下同时糖化和发酵含淀粉材料。2.权利要求1的方法，其中所述金属蛋白酶来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选为桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的菌株。3.权利要求2的方法，其中所述蛋白酶具有作为SEQIDNO:1的氨基酸1-177公开的氨基酸序列，或与其具有至少约80%、或至少约82%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约97%的同一性的金属蛋白酶。4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料是粒状淀粉。5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料来自全谷粒。6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料来自玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻或马铃薯。7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中发酵在3-7，优选3.5-6或更优选4_5的pH范围进行。8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述方法进行1-96小时，优选进行6到72小时。9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料的干固体含量在20-55w/w%、优选为25-40w/w%，更优选30-35w/w%的范围。10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述糖浓度在同时糖化和发酵中保持在约6w/w%以下，优选约3w/w%以下的水平。11.权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料通过将含淀粉材料的粒度减少到0.1-0.5mm的粒度来制备。12.权利要求10的方法，其中所述含淀粉材料粒度的减少是通过磨制，优选干磨进行的。13.权利要求1-12任一项所述的方法，其中在同时糖化和发酵中的温度为25-40°C，如28-350C，如30-340C，如约32°C。14.权利要求1-13任一项所述的方法，其中还存在α-淀粉酶。15.权利要求14的方法，其中所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶。16.权利要求14或15的方法，其中所述α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，优选来源于曲霉属(Aspergillus)，特别是黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)或川地曲霉(Aspergilluskawachii)的菌株，或来源于根毛霉属(Rhizomucor)，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)的菌株，或来源于亚灰树花菌属(Meripilus)，优选大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)的菌株。17.权利要求14-46任一项所述的方法，其中所述α-淀粉酶以0.001到10AFAU/gDS,优选0.01到5AFAU/gDS,特别为0.3到2AFAU/gDS或0.001到lFAU-F/gDS，优选0.01到lFAU-Fg/DS的量存在。18.权利要求1-17任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶选自下组葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、产麦芽糖淀粉酶和β-淀粉酶。19.权利要求1-18任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，并以·0.001-10AGU/gDS，优选0.01_5AGU/gDS，特别是0.1-0.5AGU/gDS的量存在。20.权利要求14-19任一项所述的方法，其中当步骤(a)和(b)同时进行时，所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶以1-100AGU/FAU-F，优选2-50AGU/FAU-F，特别是10-40AGU/FAU-F的比例添加。21.权利要求18的方法，其中所述葡糖淀粉酶来源于曲霉属的菌株，优选黑曲霉或泡盛曲霉的菌株，踝节菌属(Talaromyces)的菌株，特别是埃莫森踝节菌(Talaromycesemersonii)的菌株，或阿太菌属(Athelia)的菌株，特别是罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)的菌株，栓菌属(Trametes)的菌株，优选瓣环栓菌(Trametescingulata)的菌株，大纹饰包IifM(Pachykytospora)白勺，^^ΙΜλΙΙ^包胃(Pachykytosporapapyracea)白勺菌株，或白Ι属(Leucopaxillus)的菌株，优选大白(Leucopaxillusgiganteus)的菌株，或隔孢伏革菌属(Peniphora)的菌株，优选红边隔孢伏革菌(Peniphorarufomarginata)的菌株，或其混合物。22.权利要求1-21任一项所述的方法，其中所述发酵产物在发酵后回收。23.权利要求1-22任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇，特别是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。24.权利要求1-23任一项所述的方法，其中所述发酵生物是酵母，优选是酵母属(Saccharomyces)白勺胃_，牛寺另Ui酉良胃―(Saccharomycescerevisiae)白勺胃_。25.一种从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤(a)在α-淀粉酶存在下液化含淀粉材料；(b)使用糖源生成酶糖化在步骤(a)中获得的经液化的材料；(c)使用发酵生物进行发酵；其中金属蛋白酶在i)发酵过程中，和/或ii)液化之前、过程中和/或之后存在。26.权利要求25的方法，其中所述金属蛋白酶来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。27.权利要求26的方法，其中所述蛋白酶具有SEQIDNO:1公开的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性的蛋白酶。28.权利要求25-27任一项所述的方法，其中步骤(a)在pH4.0-6.5，优选在pH4.5-6进行。29.权利要求25-28任一项所述的方法，其中所述发酵产物在发酵之后回收，优选通过蒸馏进行。30.权利要求25-29任一项所述的方法，其中步骤(b)和(c)顺序进行或同时进行(即，SSF方法)。31.权利要求25-30任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇，特别是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。32.权利要求25-31任一项所述的方法，其中所述含淀粉的起始材料是全谷粒。33.权利要求25-32任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料来源于玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯淀粉(manioc)、树薯、高粱、稻或马铃薯，或由其来源的淀粉。34.权利要求25-33任一项所述的方法，其中发酵生物是酵母属的菌株，优选酿酒酵母的菌株。35.权利要求25-34任一项所述的方法，在步骤(a)前还包括下述步骤χ)减少含淀粉材料的粒度；y)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。36.权利要求35的方法，其中所述浆料被加热到糊化温度以上。37.权利要求36的方法，其中所述浆料在95-140°C，优选105_125°C喷射蒸煮1_15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。38.权利要求25-37任一项所述的方法，其中其中支链淀粉酶在i)发酵过程中，和/或)液化之前、过程中和/或之后存在。39.一种组合物，其包含金属蛋白酶和糖源生成酶和α-淀粉酶。40.权利要求39的组合物，其中所述金属蛋白酶来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670，与SEQIDNO:1具有至少80%同一性的同源金属蛋白酶。41.权利要求39或40的组合物，其中所述糖源生成酶选自下组葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、产麦芽糖淀粉酶、和淀粉酶。42.权利要求41的组合物，其中所述糖源生成酶选自来源于下述菌株的葡糖淀粉酶:曲霉属，优选黑曲霉或泡盛曲霉的菌株，踝节菌属，特别是埃莫森踝节菌的菌株，或阿太菌属，特别是罗耳阿太菌的菌株，栓菌属，优选瓣环栓菌的菌株，大纹饰孢菌属的菌株，优选纸质大纹饰孢菌的菌株，或白桩菇属，优选大白桩菇的菌株，或隔孢伏革菌属的菌株，优选红边隔孢伏革菌的菌株，或其混合物。43.权利要求39-42任一项所述的组合物，其中所述α-淀粉酶选自下组真菌α-淀粉酶，优选来源于曲霉属，特别是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉或川地曲霉的菌株，或来自根毛霉属，优选微小根毛霉的菌株，或来源于亚灰树花菌属，优选大型亚灰树花菌的菌株。44.一种组合物，其包括金属蛋白酶和支链淀粉酶。45.权利要求44的组合物，其中所述金属蛋白酶来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670，与SEQIDNO:1具有至少80%同一性的同源金属蛋白酶。46.权利要求44或45的组合物，其中所述支链淀粉酶来源于火球菌属(Pyrococcus)的菌株，优选沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)的菌株，特别是公开于W092/02614的沃氏火球菌DSMNo.3773，其中成熟蛋白是与SEQIDNO:6具有至少80%同一性的同源支链淀粉酶。47.权利要求44-46任一项所述的组合物，还包含糖源生成酶或α-淀粉酶。48.权利要求47的组合物，其中所述糖源生成酶选自来源于下述菌株的葡糖淀粉酶曲霉属，优选黑曲霉或泡盛曲霉的菌株，踝节菌属，特别是埃莫森踝节菌的菌株，或阿太菌属，特别是罗耳阿太菌的菌株，栓菌属，优选瓣环栓菌的菌株，大纹饰孢菌属的菌株，优选纸质大纹饰孢菌的菌株，或白桩菇属，优选大白桩菇的菌株，或隔孢伏革菌属的菌株，优选红边隔孢伏革菌的菌株，或其混合物。49.权利要求47的组合物，其中所述α-淀粉酶选自下组真菌α-淀粉酶，优选来源于曲霉属，特别是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉或川地曲霉的菌株，或来自根毛霉属，优选微小根毛霉的菌株，或来源于亚灰树花菌属，优选大型亚灰树花菌的菌株。50.金属蛋白酶在将糊化和/或未糊化的含淀粉材料发酵为发酵产物的方法中的用途。51.金属蛋白酶和支链淀粉酶在将糊化的含淀粉材料发酵为发酵产物的方法中的用途。专利摘要本发明涉及从糊化和/或未糊化的含淀粉材料使用金属蛋白酶产生发酵产物的方法，以及从糊化和/或未糊化的含淀粉材料使用金属蛋白酶和支链淀粉酶产生发酵产物的方法。文档编号C12P7/06GKCN102083991SQ200980123905公开日2011年6月1日申请日期2009年6月23日发明者兰迪·德因哈默,刘继银,宋子良,彼得·R·奥斯特加德,福山志朗,苏珊娜·克拉克,马丁·S·博彻特申请人:诺维信公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan