专利名称：：产生发酵产物的方法
技术领域：
：本发明涉及从木素纤维素原料中产生发酵产物的酶学方法。
背景技术：
：随着世界范围内石油、天然气资源的逐渐衰竭，需要提供替代能源。如今，通过发酵含有淀粉的原料，大量生产燃料乙醇。也有人建议从木素纤维素原料中生产乙醇，因为此类原料为廉价且可再生的碳源。木素纤维素原料(通常称为生物质(biomass))是大多数植物主要的结构组分，包括纤维素、半纤维素以及木质素。WO2004/099381涉及以外源木糖异构酶基因转化的遗传修饰酵母，该基因能增强酵母将木糖发酵为乙醇和其它所需发酵产物的能力。Chandrakant等(ApplMicrobiolBiotechnol(2005)53:301-309)公开了啤酒糖酵母(5"acc/zoramycesceWWae)对葡萄糖与木糖的同时异构化和共发酵。发酵葡萄糖的酵母也发酵木酮糖，此木酮糖是木糖异构酶作用于木糖而产生的。为了经济地开发木素纤维素原料，必须有效地将木糖转变为乙醇或其它所需发酵产物。因此，有必要改进从木素纤维素原料中产生发酵产物的方法。发明概述本发明提供了从木素纤维素原料中产生发酵产物，特别是乙醇的方法。本发明第一个方面涉及从木素纤维素原料中产生发酵产物的方法，其中该方法包括以下步骤i)对木素纤维素原料进行预处理，以释放或分离纤维素、半纤维素和/或木质素，ii)所述预处理的原料用纤维素酶进行处理，iii)在发酵有机体存在时，进行发酵，其中在步骤ii)和/或步骤iii)中加入木糖异构酶。本发明的方法可以用于产生大量的发酵产物，包括醇(如乙醇、曱醇和丁醇)；有机酸(如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(如丙酮)；氨基酸(如谷氨酸)；糠醛，气体(如&和C02)以及更加复杂的化会物，例如，包括抗生素(如青霉素和四环素)、酶、维生素(如核黄素、B12,p-胡罗卜素)、激素以及其它难以通过合成产生的化合物。发酵产物也可以为々束用酒精(如啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如，在酸奶和奶酪的生产中)、皮革以及烟草行业制品。图1所示为C02的损耗，其与试验中乙醇的产量成正比，该实验向含有葡萄糖和木糖的预处理的玉米秸(PCS)中添加或未添加木糖异构酶。发明详述本发明提供从木素纤维素中产生发酵产物的方法。本发明的发酵过程总的来说本发明的方法包含四个主要的步骤预处理、水解预处理的原料、发酵以及任选地回收所述的发酵产物，如乙醇。本发明第一个方面涉及从木素纤维素原料中产生发酵产物的方法，其中该方法包括以下步骤i)对木素纤维素原料进行预处理，以释放或分离纤维素、半纤维素和/或木质素，ii)所述预处理的原料用纤维素酶进行处理，iii)在发酵有机体存在时，进行发酵，其中在步骤ii)和/或步骤iii)中加入木糖异构酶。在一实施例中，步骤ii)中的预处理通过组合使用纤维素酶与木糖异构酶进行。在另一实施例中，发酵步骤iii)在发酵有机体和木糖异构酶存在时进行。预处理一步骤i)依据本发明，预处理木素纤维素原料是为了提高酶的水解速度并进一步提高发酵产物的产量。进行步骤i)的预处理是为了分离和/或释放纤维素、半纤维素和木质素。木素纤维素原料在预处理过程中的含量可以为10-80wt.%，优选20-50wt.%。其目的是打破木质素密封层(seal),并破坏木素纤维素原料6的晶体结构。在以后的处理步骤中，当碳水化合物聚合物(例如纤维素和半纤维素)转变为可发酵的己醣和戊糖时，木素纤维素原料的结构被改变，特别是聚合物的组成更易于被酶水解接近。步骤i)的预处理可以以任意适宜的方式进行，以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素。适宜的预处理方法例如见Schell等(Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108，p.69-85,2003)以及Mosier等(BioresourceTechnology96(2005)673-686)，其在此引入作为参考。在优选的实施例中，以化学和/或机械的方式处理木素纤维素原料。化学和/或机械处理在本发明的优选实施例中，化学处理和机械处理(后者通常称为物理处理)可单独使用或与随后的或同时的酶促步骤组合使用，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从木素纤维素原料中分离和/或释放。在预处理步骤中，化学和/或机械处理步骤优选在酶促步骤之前进行，以改善在此所述的酶促步骤。作为选择，化学和/或机械处理步骤可与一或多个酶促步骤同时进行，如可同时加入一或多种半纤维素酶，以释》文木糖和其它的半纤维素糖。在加入或者未加半纤维素酶的情况下，预处理步骤也可以和步骤ii)(参见下文)同时进行。化学处理如本发明所述，"化学处理"指可用来促进纤维素、半纤维素和/或木质素从木素纤维素原料中分离和/或释放的任意化学处理方法。适宜的化学处理方法的实例包括，例如酸处理和碱处理，稀酸(diluteacid)、石灰(lime)和氨(ammonia)预处理，湿法氧化(wetoxidation)以及溶剂处理。化学处理方法优选为酸处理方法，更优选为连续的稀酸或温和酸(mildacid)处理，如用碌^酸或另一种有才几酸，如乙酸、4宁檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物进行处理。也可使用其它的酸。在本发明的上下文中，温和酸处理是指处理时pH介于l-5，优选l-3。在具体的实施例中，酸的浓度范围为0.1-2.0wt.%的硫酸。将酸与木素纤维素原料混合或接触，并且将混合物在160-220。C(如165-195。C)维持数分钟至数秒，例如l-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可加入^Tu酸以除去半纤维素。其可增强纤维素的可消化性。依据本发明，也可以考虑使用碱，如NaOH或Na2C03进行碱化学处理(alkalinechemicaltreatment)。已显示，纤维素溶剂处理能将90%的纤维素转变为葡萄糖，还显示一旦生物质的结构被破坏，可极大地促进酶水解。碱性的11202、臭氧(ozone)、有机溶胶((organosol)(使用含水醇溶液中的路易斯酸(Lewisacids)、FeCl3、(A12)S04)、甘油、二氧六环(dioxane)、酚或乙二醇均为已知的能破坏纤维素结构和促进水解的溶剂的例子(Mosieretal.BioresourceTechnology96(2005),p.673-686)。湿法氧化技术涉及使用氧化剂，如基于亚硫酸根的氧化剂及其类似物。溶剂处理的实施例包括，用DMSO(二曱基亚砜)及其类似物处理。化学处理方法一般进行约5-10分钟，但可也可以进行更短或更长的时间。机械处理如本发明所述，术语"机械处理"指可用来促进纤维素、半纤维素和/或木质素从木素纤维素原料中分离和/或释放的任意机械或物理处理方法。机械处理包括粉碎(comminution)(机械减小生物质颗粒大小)、蒸汽爆炸(steamexplosion),水热解(hydrothermolysis)。粉碎包括干振动球研磨和湿振动球研磨。优选的机械处理方法包括使用高压和/或高温的方法(蒸汽爆炸)。在本发明的上下文中，高压指压力为300-600psi，优选400-500psi,如450psi左右。在本发明的上下文中，高温指温度为100-300°C,优选140-235。C。在具体的实施例中，在压力约450psi、温度约235。C进行浸渍(impregnation)。更优选，机械处理为使用高压和高温进行分批处理(batch-process)的蒸汽喷射水解器(steamgunhydrolyzer)体系,如，4吏用SoundsHydrolyzer(可乂人瑞典的SoundsDefibratorAB获得)。化学处理和机械处理的组合在优选的实施例中，既进行化学处理又进行机械处理，如既进行稀酸或温和酸处理又进行高温高压处理。化学处理和机械处理可以根据需要顺序进4亍或同时进4亍。因此，在优选的实施例中，该过程包括用化学方法和机械方法两者预处理木素纤维素原料，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。在优选的实施例中，步骤i)的预处理是用稀酸或温和酸进行的蒸汽爆炸步骤。在另一个优选的实施例中，步骤i)的预处理是氨纤维爆炸步骤(旦mmoniafiber^plosionstep,称AFEX预处理步骤)。在本发明的实施例中，可通过蒸汽蒸馏(steamstripping)改善木素纤维素原料(例如经稀酸水解的原料，如玉米秸(comstover))的可发酵性，以解去该材料的毒性。水解一步骤ii)如上所述，预处理木素纤维素原料以分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素。在步骤ii)中，碳水化合物聚合物转变为单糖。纤维素可以用纤维素酶(参见下文"纤维素酶"部分)或化学方法(参见上文"化学处理"部分)酶促水解为葡萄糖。半纤维素可以被半纤维素酶或酸水解而降解，释放其五碳糖和六碳糖组分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖和甘露糖，可以很容易被适当的发酵有机体(包括酵母)发酵为例如乙醇、丙酮、丁醇、丙三醇、柠檬酸和延胡索酸。乙醇发酵中优选的酵母为啤酒糖酵母，其对高水平的乙醇，即，例如最多至约10-15vol.%或更多的乙醇有抵抗性。但是，对于在木素纤维素原料如硬木(hardwood)、农业废物(agriculturalresidues)以及草(grasses)中含量通常相当大的五碳糖(戊糖)如木糖来说，它(们)仅能被少数发酵有机体发酵，得到例如乙醇，且产量很小。在本发明的一实施例中，预处理的木素纤维素原料的量在步骤ii)中可以是约10-50wt.%,优选约15-35wt.%,特别是约20-30wt.%。在一实施例中，预处理步骤ii)可以在纤维素酶或纤维素酶和木糖异构酶的组合存在时进行。木糖异构酶还可以出现于随后的发酵步骤iii)中。在优选的实施例中，步骤i)中获得的预处理的木素纤维素原料首先以半纤维素酶处理，优选以木聚糖酶、酯酶、纤维二糖酶或其组合处理。或者，步骤ii)在半纤维素酶和/或纤维素酶和/或木糖异构酶的组合存在时进行。可加入半纤维素酶以提供来自半纤维素组分的更多可利用的木糖和其它糖，包括葡萄糖。然而，根据本发明，半纤维素酶处理并非是强制性的。纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖。木糖异构酶将木糖转变为木酮糖，后者在酵母如啤酒糖酵母的发酵过程中能被转变为所需发酵产物，如乙醇。据信，在步骤ii)和/或步骤iii)中加入木糖异构酶，导致对纤维素酶作用进行的木糖抑制被降低。换句话说，通过将木糖转变为木酮糖，降低了对纤维素酶的抑制作用。在优选的实施例中，木糖异构酶先于纤维素酶加入。在优选的实施例中，木糖连续地转变为木酮糖然后被发酵。由于木糖异构化为木酮糖，降低了木糖的含量，可以提高纤维素转化速率。这降低了用于产生所需发酵产物(如乙醇)的处理时间。而且，木素纤维素原材料得以更有效地利用，因为木素纤维素原料如玉米秸，包含大约35wt.%的纤维素和25%的木聚糖。酶处理在适宜的水环境中、在本领域技术人员很容易确定的条件下进行。在优选的实施例中，步骤ii)在所用纤维素酶和/或木糖异构酶的最佳条件下进行。适宜的处理时间、温度和pH条件是本发明领域技术人员可以4艮容易地确定的。优选，步骤ii)在30-70。C进行，优选40-60。C，特别是约50。C。优选，步骤ii)在pH3-8进行，优选pH4-6，特别是约pH5。优选，步骤ii)进行8-72个小时，优选12-48个小时，特别是约24个小时。发酵一步骤iii)步骤iii)为发酵步骤，包括但不局限于，用于产生任一发酵产物的发酵，该发酵产物包括醇(如乙醇、曱醇、丁醇)、有机酸(如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)、S同(如丙酮)、氨基酸(如谷氨酸)、气体(如H2和C02)、抗生素(如青霉素和四环素)、酶、维生素(如核黄素、B12、P-胡罗卜素)以及激素。步骤iii)也可是用于饮用醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业以及烟草工业中的发酵步骤。在优选的实施例中，发酵步骤iii)为醇发酵。优选发酵步骤iii)是厌氧的。在实施例中，步骤ii)加入的一或多种酶，即半纤维素酶、纤维素酶、木糖异构酶，在发酵过程中也具有活性。然而，也可以考虑在步骤iii)中加入更多的半纤维素酶、纤维素酶、木糖异构酶、或其组合。换句话说，在实施例中，步骤iii)可以同时进行异构化和发酵步骤，以便木糖异构酶将木糖转变为木酮糖，发酵有机体(如酵母)将木酮发酵为所需发酵产物，如乙醇。发酵有机体术语"发酵有机体"指适宜产生所需发酵产物的任意有机体，包括细菌有机体和真菌有机体。根据本发明，特别适宜的发酵有机体能将糖(如木酮糖和/或葡萄糖)直接或间接地发酵(即转化)为所需发酵产物。发酵有机体的实例包括真菌有机体，如酵母。优选的酵母包括糖酵母属种类(&cc/z"ramyc^spp)的菌抹，特别是啤酒糖酵母或葡萄汁糖酵母(S.Mvarwm)的菌抹；毕赤酵母属(尸/c/^)菌抹，优选柄状毕赤酵母(P幼>/他)，如柄状毕赤酵母CBS5773;假丝酵母属(Om^^)菌林，特别是产朊假丝酵母(C.W/fe)，迪丹氏假丝酵母(C.A^fera/0或博伊丁氏假丝酵母(C.幻Wm7)菌抹，它们能发酵葡萄糖和木酮糖产生乙醇。其它可考虑的酵母包括发酵单胞菌属(Z;ymomoww)菌抹；汉逊氏酵母属(//""^做^),特别是异常汉逊氏酵母(//.朋oma/a)菌抹；克鲁维酵母属(《/z<yvmm_yce"，特别是脆壁克鲁维酵母(K./ragW力菌林；以及裂殖糖酵母属(Sc/n^wacc/^ram少c&sO，特别是粟酒裂殖糖酵母(S./70w6e)菌株。可购买到的酵母包括如REDSTAR/LesaffreEthanolRed(可从美国RedStar/Lesaffre获4寻)、FALI(可乂人美国BurnsPhilpFoodInc.的分支Fleischmannn，sYeast获得)、SUPERSTAR(可从Alltech获得)、GERTSTRAND(可从瑞典的GertStrandAB获得)以及FERMIOL(可从DSMSpecialties获得)。同时进行水解和发酵在一实施例中，本发明的方法所用的木糖异构酶在适于发酵有机体的温度附近具有显著的活性。在这种情况下，步骤ii)和步骤iii)中的水解和发酵可同时进行。"显著的活性"是指在最佳发酵条件下所获得的活性的至少50%,优选至少60%，更优选至少70%,更优选80%,再更优选至少90%，再更优选在最佳发酵条件下的活性的至少95%。在优选的实施例中，最佳的发酵条件是温度为28-40。C，优选32。C左右，且pH为3-7，优选3.5-5左右。通常，如果木糖异构酶要求的条件与发酵有机体所需的最佳条件显著不同，则在发酵启动前，完成水解步骤。当木糖异构酶来自博伊丁氏假丝酵母(Kloeckem)，特别是博伊丁氏假丝酵母(Kloeckera2201)(DSM70034或ATCC4818)(如下文所述)，则可以在约28-40°C同时进行水解和发酵，优选约30-38°C,特别是约32。C，且pH约3-7,优选约3.5-5。ii木素纤维素原料(lignocellulosicmaterial)木素纤维素原料为碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)与木质素的异质复合物。纤维素，如同淀粉，为葡萄糖的同质聚合物。但，和淀粉不同，纤维素的特殊结构有利于聚合物链排列为高度紧密、高度结晶的结构，该结构不溶于水且能抵抗解聚作用。半纤维素为葡萄糖或木糖的支链聚合物，在不同的物种中，它具有阿拉伯糖、木糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖或葡糖酸取代(MosieretalBioresourceTechnology96(2005)673-686)。木质素为芳香醇(aromaticalcohol)的不溶性高分子量物质，它加固木素纤维素原料。通常木质素包含三种芳香醇(+>柏醇、芥子醇、以及p-香豆醇(p-coumarylalcohol))。另外禾本科植物和双子叶植物的木质素还含有大量的酚酸(phenolicacids),如p-香豆酸(p-coumaricacid)以及阿魏酸，所述酚酸相互酯化到彼此的醇基团上，并且酯化到其它的醇(如芥子醇和p-香豆醇)上。木质素进一步和半纤维素以及纤维素连接，在后两者周围形成物理密封部分，该密封部分为不可穿透的屏障,阻止;容'液和酶的穿透(HowardR.Letal,AfricanJournalofBiotechonologyVol.2(12)pp,602-619,December2003)。依据本发明，可以使用任意适宜的木素纤维素原料。适宜用于本发明方法的可考虑的木素纤维素原料的实例，包括秸(stover)、穗轴(cob)、茎(stalk)、果壳(husk)、糠(bran)、种子(seed)、果皮(peel)、果核(fmitstone)、荚(shell)、甘y^j查(bagasse)、类月巴(manure)、废才才(woodresidues)、才对皮(bark)、冲对口十(leave)、木屑(woodchip)、刨花(woodshaving)、锯末(sawdust)、纤维废冲牛(fiberwaste)、才艮纟氏(newspapers)、办乂iH氏(officepaper)、卡纟氏才反(cardboard)、草(grass)等。在本发明的优选实施例中，木素纤维素原料包括玉米秸、玉米纤维(comfiber)、;^木(pinewood)、木屑(woodchip)、才为杉于(poplar)、麦岸干(wheatstraw)、杉卩4支牙夏(switchgrass)以及纸张或其混合物。酵半纤维素酶在本发明的实施例中，用半纤维素酶处理已预处理的木素纤维素原料。任何适于在半纤维素水解为木糖的过程中使用的半纤维素酶都可以用。在本发明的方法中，优选所用的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰基木聚糖酯酶(acetylxylanesterase)、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖香酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶(arabinase)、外切半乳聚糖酶(exo-galactanses)、及其混合物。本发明所用的半纤维素酶优选为具有外切活性(ex-acting)的半纤维素酶，更优选，半纤维素酶为在pH低于7优选pH为3-7的酸性条件下能水解半纤维素的外切半纤维素酶。适于本发明所用的半纤维素酶的实例包括VIS-COZYMETM(可从丹麦的NovozymesA/S获得)。半纤维素酶的加入量是有效分解纤维素形成木糖的量，如，约0.001-0.5wt.%总固体(TS)，更优选约0.05-0.5wt.%TS。纤维素酶根据本发明，可以使用任一能将纤维素水解为葡萄糖的纤维素酶。依据本发明所用的纤维素酶活性可以来自任意适宜的来源，优选纤维素酶具有微生物来源，如来自丝状真菌(如曲霉属C^;wg〃/w力、木霉属(7Hc/zoc^ma)、腐质霉属(7/w脂'co/a)、镰刀菌属CFwran'MW)、草根霉属(77^/av/fl))菌林。优选，纤维素酶组合物对纤维素原料和木素纤维素原料都起作用。本发明所用的优选的纤维素酶包括具有外切活性的纤维素酶和纤维二糖酶以及其组合。更优选包括用纤维二糖酶和具有外切活性的纤维素酶的组合进行处理。优选，纤维素酶在pH低于7的酸性条件下，能水解纤维素或木素纤维素。适于本发明所用的纤维素酶的实施例包括，例如，CELLULCLAS丁tm(可从NovozymesA/S获得)，NOVOZYM188(可从NovozymesA/S获得)。其它可购买到的含可以使用的纤维素酶的制剂包括CELLUZYME、CEREFLO和ULTRAFLO(NovozymesA/S)、LAMINEX和SPEZYMECP(GenencorInt.)以及ROHAMENT7069W(来自R6hmGmbH)。在步骤ii)中加入一或多种纤维素酶，其添加量是能将预处理的木素纤维素原料中的纤维素水解为葡萄糖的有效量，如产生0.1-100FPU/g总固体(TS)、优选0.5-50FPU/gTS、特别是1-20FPU/gTS的活性水平的量，或者是0.1-100mg酶蛋白/g总固体(TS),优选0.5-50mg酶蛋白/gTS，特别是20mg酶蛋白/gTS。木糖异构酶木糖异构酶(D-木糖酮异构酶(D-xyloseketoisomerase))(E.C.5.3.1.5)是催13化D-木糖到D-木酮糖的可逆异构化反应的酶。一些木糖异构酶也能催化D-葡萄糖到D-果糖的可逆异构化。因此，木糖异构酶有时称为"葡萄糖异构酶"。本发明的方法所用的木糖异构酶可以为具有木糖异构酶活性的任何酶且可以为任意来源的，优选为细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母来源。细菌木糖异构酶的实例包括属于链霉菌属(5^印tomyces)、游动放线菌属(J"/"op/朋e5)、芽孢杆菌属(3""7/w"、黄杆菌属(F/avo6acen'ww)以及热袍菌属(7Tzermotoga)的种类，包括新阿波罗栖热^包菌(7:"eqpo/Zto"a)(Vieilleetal,Appl.Environ.Microbiol.1995,61(5),1867画1875)以及海栖热对包菌(7:mw/"ma)。真菌木糖异构酶的实例来自担子菌门CSosWomycetes)的物种。优选的木糖异构酶为来自假丝酵母属(OwA^0的酵母菌抹，优选博伊丁氏假丝酵母菌林，特别是例如Vongsuvanlert等1988年在Agric.Biol.Chem.52(7):1817-1824中所公开的博伊丁氏假丝酵母木糖异构酶。木糖异构酶优选来自博伊丁氏假丝酵母(Kloeckera2201)，该菌抹的保藏号为DSM70034和ATCC48180，为Ogata等在Agric.Biol.Chem,Vol.33，p.1519-1520或Vongsuvanlert等1988年在Agric.Biol.Chem,52(2),p.1519-1520中公开。在一个实施例中，木糖异构酶来自链霉菌属(5V^pto^yc^),如来自鼠灰链霉菌(5:w訓'""力菌株(美国专利号4，687，742),以及公开于美国专利号3，616,221中的黄微绿链霉菌(S.y7avovz>era)、白色链霉菌(S.ac/zramoge"""、多刺链霉菌(S.ec/2/"a^s)和威德摩尔链霉菌(S.vt^/附wera^)。其它的木糖异构酶公开于美国专利号3,622,463、4,351,903、4,137,126、3,625,828、匈牙利专利号12,415、德国专利号2,417,642、日本专利号69，28，473和WOMO4/044129中(所有这些专利在此引入作为参考)。木糖异构酶可以为固定化形式，也可以为液体形式，优选液体形式。加入木糖异构酶以提供在0.01-100IGIU/g总固体的范围内的活性水平。商业上可利用的木糖异构酶的实例包括来自丹麦NovozymesA/S的SWEETZYMETMT。回收在优选的实施例中，回收发酵产物，例如，通过使用本领域已知的任一蒸馏法。发酵醪液可以经蒸馏来提取发酵产物，特别是乙醇。根据本发明所获得的终产物可以用作，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即适于饮用的酒精(potable14neutralspirits);或工业乙醇。有关如何进行磨碎、液化、糖化作用、发酵、蒸馏以及乙醇回收的进一步详情，为本领域技术人员所熟知。对本领域的技术人员而言，对在此所述的本发明做各种改善是显而易见的。此类改善在本发明权利要求范围内。材料和方法木糖异构酶:固定化的木糖异构酶来自鼠灰链霉菌(S.mMn力w"并公开于美国专利号4，687,742中。木冲唐异构酶:来自Vongsuvvanlert等1988年在Agric.Biol.Chem.52(2)，p.419-426中所描述的博伊丁氏假丝酵母菌抹(Kloeckera2201akaDSM70034akaATCC48480)。纤维素酶:源自里氏木霉(7Hc/wAm2a"ew")的纤维素酶复合物，可作为CELLUSCLAST1.5L从丹麦的NovozymesA/S购得。纤维二jf唐酶:纤维二糖酶来自黑曲霉(A/wg/〃w，可作为Novozym188从丹麦的NovozymesA/S购得。酵母RedStarTM，可从美国的RedStar/Lesaffre购得。方法木糖/葡萄糖异构酶试验(IGIU)1IGIU为在标准分析条件下，以1微摩尔/分钟的初始速率将葡萄糖转变为果糖的酶量。标准条件葡萄糖浓度pH:Mg2+浓度。32+浓度激活剂，S02浓度緩沖液，Na2C03浓度45%w/w7.560。C99mg/l(1.0g/1MgS04*7H20)<2ppm100ppm(0.18g/lNa2S2O5)2mMNa2C03以滤纸试验法(FPUassay)测量纤维素酶的活性1.方法来源1.1本方法参见题为"MeasurementofCellulaseActivities"的文献(Adney，B.andBaker,J.1996.LaboratoryAnalyticalProcedure,LAP-006,NationalRenewableEnergyLaboratory(NREL))。其基于测定纤维素酶活性的IUPAC法(Ghose,T.K.，MeasurementofCellulseActivities,Pure&Appl.Chem.59,pp.257-268,1987)。2.步骤2.1按上述Adney和Baker1996描述的方法进行，不同的是使用96孔板在显色(colordevelopment)后读取吸光率，如下所述。2.2酶试验管2.2.1将巻起的滤纸条(#1Whatman;1x6cm;50mg)加入试验管(13x100mm)的底部。2.2.2向试管中加入1.0mL的0.05M柠檬酸钠緩沖液(pH4.80)。2.2.350。C(士0.rC)将含滤纸和緩冲液的试管在循环水浴中温育5分钟。2.2.4温育后，将0.5mL经柠檬酸緩沖液稀释的酶加入到试管中。酶稀释度事先设计以产生稍微高于和低于2.0mg葡萄糖目标值的值。2.2.5温和涡旋三秒钟，使试管内容物混合。2.2.6涡旋后，将试管在循环水浴中50。C(土0.1。C)温育60分钟。2.2.760分钟温育后，将试管^v水浴中拿出，向每一个试管中加入3.0mL的DNA试剂以终止反应。将试管涡旋3秒钟以便混合。2.3空白和对照2.3.1向试管中加入1.5mL柠檬酸緩沖液，制备试剂空白(reagentblank)。2.3.2向试管底放置巻起的滤纸条，并加入1.5mL柠檬酸缓沖液，制备底物只寸照(substratecontrol)。2.3.3将l.OmL柠檬酸緩冲液与0.5mL相应酶稀释物混合，制备每一酶稀释物的酶对照(enzymecontrols)。2.3.4试剂空白、底物对照和酶对照，以与酶试^^管相同的方式，与酶试验管一起进行试验。2.4葡萄糖标准品2.4.1100mL葡萄糖原液(10.0mg/mL)，按5mL的等分试样进行冰冻。使用前，将等分试样解冻，并通过涡旋进行混合。2.4.2如下述在柠檬酸緩冲液中制得原液的稀释物Gl=1.0mL原液+0.5mL緩沖液=6.7mg/mL=3.3mg/0.5mLG2=0.75mL原液+0.75mL緩沖液=5.0mg/mL=2.5mg/0.5mLG3=0.5mL原液+1.0mL緩冲液=3.3mg/mL=1.7mg/0.5mLG4=0.2mL原液+0.8mL緩沖液=2.0mg/mL=1.0mg/0.5mL2.4.3向1.0mL的柠檬酸緩沖液中加入0.5mL的稀释物，制得葡萄糖标准品试管。2.4.4葡萄糖标准品试管以与酶试验管相同的方式，与酶试验管一起进行试验。2.5显色(colordevelopment)2.5.1温育60分钟并加入DNS后，将所有试管一起在水浴中煮沸5分钟。2.5.2煮沸后，立即将它们在冰/水浴中冷却。2.5.3冷却后，短暂地涡旋试管，并使浆液沉积。接着每一个试管中取50微升加入96孔板中200微升的ddH20中进行稀释。对每一孔进行混合，读取540nm的吸光率。2.6计算(NREL文献中给出了例子)2.6.1绘制四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)对As4o的曲线图，制得葡萄糖标准曲线。该曲线用线性回归(Prism软件)调整(fit),用适于所述线的等式确定每一酶试验管中产生的葡萄糖。2.6.2绘制葡萄糖产量(mg/0.5mL)对总的酶稀释度的图，使Y轴(酶稀释度)为log值。2.6.3在产生刚好高于2.0mg葡萄糖的酶稀释度和产生刚好低于2.0mg葡萄糖的酶稀释度之间绘制一条线。基于这条线确定恰好产生2.0mg葡萄糖的酶稀释度。2.6.4滤纸单位/mL(FPU/mL)如下计算FPU/mL=0.37/产生2.0mg葡萄糖的酶稀释度测定纤维二糖酶活性(CBU)纤维二糖酶(P-葡糖苷酶EC3.2.1.21)水解纤维二糖中的p-l,4键，释放两分子的葡萄糖。用己糖激酶法如下述特异性定量测定葡萄糖的释放量己糖激酶葡萄糖+ATP-葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)+ADP葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G陽6-P+NADP+-葡糖酸-6-石舞酸+NADPH+H+因NADPH在340nm波长处的吸光率高，故随后测量在此波长处吸光率的增力口。反应条件反应温度40°CpH:5.0检测反应时间15分波长340nm一个纤维二糖酶单位(CBU)是以纤维二糖为底物，在以上标准条件下，每分钟释放2微摩尔葡萄糖的酶量。更详细描述该分析方法的小册子(EB-SM-0175.02/02)可向丹麦的NovozymesA/S索要，其在此引入作为参考。本文引用了多种文献，它们公开的完整内容在此引入作为参考。纯化博伊丁氏假丝酵母的木糖异构酶博伊丁氏假丝酵母的纯化见Vongsuvanlert等(1998)AgricBiolChem.52(7)，p.1817-1824。细胞培养的描述见Vongsuvanlert等(1988)Agric.Biol.Chem.52(2)，p.419-426。基本j咅养基，100ml配方0.4gNH4C10.1gKH2P040.1gK2HP040.05gMgS04-7H200.2g酵母提耳又物，以及0.3g聚蛋白胨(Daigo)用于接种(lgD-葡萄糖)用于生长(2gD-木糖)加入ddH20使体积变为100ml4L配方用于接种用于生长变为4L4g4g2g12g(40g)(80g)然后将pH调整为5.5接种物将博伊丁氏假丝酵母菌抹(Kloeckera2201akaDSM70034akaATCC48180)细胞在500ml带挡板烧瓶内的100ml含1%w/wD-葡萄糖的基本培养基上，28。C以200rpm摇动培养24小时，制备接种物。将接种物培养物以每500ml生长培养基中含5ml接种物培养物的稀释度，加入到2L带挡板烧瓶内由500ml含2°/。(w/v)D-木糖的基本培养基组成的生长培养基中。在28。C、200rpm往复摇动条件下，培养45小时。制备无细胞的提取物细胞经离心收集，用含0.25mMDTT的50mMKHP04pH7.0沖洗两次。接着按每克细胞团(cellpaste)lmL緩冲液的稀释度，将细胞沉淀(cellpellet)悬浮于同样的緩冲液中。将混合物装入水冷的BioSpecBead-Beater室，以每克细胞团4克玻璃珠的比例，将0.52mm的玻璃珠加入室内。加入小量蛋白酶抑制剂，将这种细胞-緩沖液-玻璃珠混合物在BioSpecBeadBeater上击打(beat)4轮，每轮为，击打1分钟接着水上静置1分钟。通过在4°C离心，将玻璃珠、细胞沉淀以及上清液分离。离心后，所得上清液用做无细胞的提〖咅养取物。纯化木糖异构酶所有的纯化步骤均是在4°C按20，000xg离心20分钟。除非另有说明，緩冲液为含有0.25mMDTT的50mMKHP04pH7.0。任一浓度的酶用YM-30膜进行Amicon超滤。步骤1:硫酸鱼精蛋白处理。将1/5体积的2%的硫酸鱼精蛋白溶液逐滴加入到无细胞的提取物中，用10。/。NH40H经搅动将pH调整为7.0，随后放置30分钟。离心，除去形成的沉淀物。步骤2:硫酸铵饱和至30%。在所得上清液中搅拌加入固体硫酸铵，直至30%的饱和度(176g/L)，用10%NH4OH将pH调为7.0。放置1小时后，离心除去形成的沉淀物，在下一步骤中使用上清液。步骤3:硫酸铵饱和至80%。在所得上清液中搅拌加入固体硫酸铵，直至80%的饱和度，用10。/。NH40H溶液将pH调为7.0。过夜放置后，所得沉淀物经离心收集，接着以最小体积的緩沖液溶解。上清液未在以下任一步骤中使用。对重悬的沉淀进行纯化，并用含有0.25mMDTT的50mMKHP04pH7.0透析过夜。步骤4:MnCl2处理。将经过透析的蛋白溶液离心，接着加入1MMnCl2-4H20至浓度为5%(w/v),用10%NH4OH经搅拌将pH调为7.0,随后放置30分钟。离心除去所得沉淀物，将所得上清液浓缩。至此，蛋白溶液含有足够纯度的木糖异构酶用于初步活性试验。可利用标准柱层析技术对样品进行进一步纯化。实施例实施例1玉米秸的木糖发酵研究了木糖异构酶对预处理的玉米秸(PCS)在有葡萄糖和木糖时的发酵的影响。玉米秸首先用约0.5%的稀硫酸预处理，接着进行蒸汽爆炸。所述预处理的材料未经压榨(press)除去水解产物，因此其含有预处理后的所有可溶物。15wt.%TSPCS在50°C,pH5进行水解，水解时有里氏木霉纤维素酶(5FPU/gTS)、黑曲霉纤维二糖酶(1.5CBU/FPU)、以及约13IGIU/gTS固定化的鼠灰链霉菌木糖异构酶。水解48小时后，用10%批量(即，繁殖物相对于总体积的比例)的酵母(啤酒糖酵母-REDSTARTM)进行接种(以确保较高的初始细胞量)，在32。C开始发酵。用含有1%酵母提取物和1%蛋白胨的生长培养基作为营养源和氮源。测定C02的损耗，其与乙醇产量成正比。在不加木糖异构酶的情况下进行同样的试验。这些试验的结果如图1所示。实施例2同时进行木糖异构化和发酵玉米秸首先用约0.5%的稀硫酸预处理，接着进行蒸汽爆炸。所述预处理的材料未经压榨或洗涤除去液态的水解产物，因此其含有预处理后的所有可溶物。随后，15wt。/。TSPCS在50。C,pH5进行水解，水解时有里氏木霉纤维素酶(5FPU/gTS)、黑曲霉纤维二糖酶(1.5CBU/FPU)。最后，在有约13IGIU/gTS博伊丁氏假丝酵母菌林(Kloeckera2201)的木糖异构酶时，在pH5进行发酵。水解48小时后，用10%批量(即，繁殖物相对于总体积的比例)的酵母(啤酒糖酵母-REDSTARtm)作为发酵有机体进行接种(以确保较高的初始细胞量)，在32。C开始发酵。用含有1%酵母提取物和1%蛋白胨的生长培养基作为营养源和氮源。发酵通过用HPLC-RI测量木糖、木酮糖、葡萄糖和乙醇来进行监控。该试验还包括对照，其未向发酵中添加木糖异构酶，因此可以确定未利用木糖时的乙醇产量。实施例3同时进行水解、木糖异构化和发酵玉米秸首先用约0.5%的稀硫酸预处理，接着进行蒸汽爆炸。所述预处理的材料未经压榨或洗涤除去液态的水解产物，因此其含有预处理后的所有可溶物。在同时进行的糖化和发酵(SSF)步骤中转化15wt.%TSPCS,使用了里氏木霉纤维素酶(5FPU/gTS)、黑曲霉纤维二糖酶(1.5CBU/FPU)、以及约13IGIU/gTS博伊丁氏假丝酵母菌林(Kloeckera2201)的木糖异构酶。同时进行的21酶处理和发酵，是在32°C、pH5，用10%批量(即，繁殖物相对于总体积的比例)的酵母(啤酒糖酵母-REDSTARTM)作为发酵有机体进行，以确保较高的初始细胞量。用含有1%酵母提取物和1%蛋白胨的生长培养基作为营养源和氮源。发酵通过用HPLC-RI测量木糖、木酮糖、葡萄糖和乙醇来进行监控。该试验还包括对照，其未向发酵中添加木糖异构酶，因此可以确定未利用木糖时的乙醇产量。权利要求1.利用木素纤维素原料产生发酵产物的方法，该方法包括以下步骤i)对木素纤维素原料进行预处理，以释放或分离纤维素、半纤维素和/或木质素，ii)所述预处理的原料用纤维素酶进行处理，iii)在发酵有机体存在时，进行发酵，其中在步骤ii)和/或步骤iii)中加入木糖异构酶。2.根据权利要求1的方法，包括以下步骤i)对木素纤维素原料进行预处理，以释放或分离纤维素、半纤维素和/或木质素，ii)所述预处理的原料用纤维素酶和木糖异构酶的组合进行处理，iii)在发酵有机体存在时，进行发酵。3.根据权利要求1的方法，包括以下步骤i)对木素纤维素原料进行预处理，以释放或分离纤维素、半纤维素和/或木质素，ii)所述预处理的原料用纤维素酶进行处理，iii)在发酵有机体和木糖异构酶存在时，进行发酵。4.根据权利要求l-3任一项的方法，其中步骤i)的预处理通过对木素纤维素原料施以化学处理和/机械处理来进行。5.根据权利要求l-4任一项的方法，其中步骤i)中的化学处理为酸处理。6.根据权利要求5的方法，其中步骤i)中的酸处理用有机酸进行，优选用硫酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、和/或它们的混合物进行。7.根据权利要求4-6任一项的方法，其中pH为l-5，优选l-3。8.根据权利要求4-7任一项的方法，其中木素纤维素原料用0.1-2.0wt.%的石克酸进行酸处理。9.根据权利要求4-8任一项的方法，其中步骤i)中的机械处理包括在高温和/或高压处理木素纤维素原料。10.根据权利要求9的方法，其中步骤i)中的机械处理在300-600psi,优选400-500psi,如约450psi的高压进4亍。11.根据权利要求9或IO的方法，其中步骤i)中的机械处理在约100-300°C,优选约140-235°C的高温进行。12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中步骤i)中的预处理是进行稀酸蒸汽爆炸、蒸汽爆炸、湿法氧化或氨纤维爆炸(或AFEX预处理)。13.根据权利要求l-12任一项的方法，其中木素纤维素原料选自玉米秸、玉米纤维、松木、木屑、杨树、麦秆、柳枝稷、办公纸。14.根据权利要求l-13任一项的方法，其中步骤ii)中木素纤维素原料的量为10-50wt.%，优选15-35wt.%，特别是20-30wt.%。15.根据权利要求l-14任一项的方法，其中将在步骤i)中获得的已释放或分离的纤维素、半纤维素和/或木质素物质用半纤维素酶处理，优选用木聚糖酶、酯酶、和/或纤维二糖酶处理，以释放木糖。16.根据权利要求1-15任一项的方法，其中在另有半纤维素酶，优选木聚糖酶、酯酶和/或纤维二糖酶存在时进行步骤ii)。17.根据权利要求l-16任一项的方法，其中纤维素酶在步骤ii)中加入，以提供0.1-100FPU/g总固体(TS),优选0.5-50FPU/gTS，特別是1-20FPU/gTS的活性水平。18.根据权利要求l-17任一项的方法，其中纤维素酶在步骤ii)中加入，且加入量为0.1-100mg酶蛋白/g总固体(TS)，优选0.5-50mg酶蛋白/gTS，特别是l-20mg酶蛋白/gTS。19.根据权利要求l-18任一项的方法，其中木糖异构酶来自酵母，优选来自假丝酵母属菌林，更优选来自博伊丁氏假丝酵母菌林，特别是博伊丁氏假丝酵母(Kloeckera)菌抹。20.根据权利要求l-19任一项的方法，其中在步骤ii)或步骤iii)中，木糖异构酶提供0.01-100IGIU/g总固体的活性水平。21.根据权利要求l-20任一项的方法，其中步骤ii)在最适于所述纤维素酶的条件下进行。22.根据权利要求1-21任一项的方法，其中步骤ii)在30-70。C，优选40-60。C,特别是约50。C进行。23.根据权利要求1-22任一项的方法，其中步骤ii)在pH3-8，优选pH4-6,特别是约pH5进行。24.根据权利要求l-23任一项的方法，其中步骤ii)进行8-72小时，优选12-48小时，特别是约24小时。25.根据权利要求l-24任一项的方法，其中步骤iii)进行24-192小时，优选48-96小时，特别是约72小时。26.根据权利要求l-25任一项的方法，其中步骤iii)中的温度约为发酵有机体的最佳发酵条件。27.根据权利要求l-26任一项的方法，其中步骤iii)中的温度为28-40°C，优选30-38。C,特别是约32。C。根据权利要求l-25任一项的方法，其中步骤iii)中的pH为3-7，优选3.5-5，特别是约4.5。.根据权利要求l-26任一项的方法，其中步骤H)和步骤iii)同时进行。28.根据权利要求l-27任一项的方法，其中在最佳发酵条件附近同时进行步骤ii)和步骤iii)。29.根据权利要求28的方法，其中同时进行的步骤是在约28-40°C，优选约30-38。C,特别是约32°C进行。30.根据权利要求28或29的方法，其中同时进行的步骤是在pH约3-7，优选约3.5-5进行。31.根据权利要求l-30任一项的方法，其中发酵有机体为酵母，优选糖酵母属，特别是啤酒糖酵母。32.根据权利要求1-31任一项的方法，其中发酵产物为乙醇。33.根据权利要求l-32任一项的方法，其中步骤ii)和步骤iii)同时进行。全文摘要本发明提供了一种产生发酵产物的方法，包括以下步骤i)对木素纤维素原料进行预处理，以释放或分离纤维素、半纤维素和/或木质素，ii)所述预处理的原料用纤维素酶进行处理，iii)在发酵有机体存在时，进行发酵，其中在步骤ii)和/或步骤iii)中加入木糖异构酶。文档编号C12P7/06GK101506372SQ200680008541公开日2009年8月12日申请日期2006年3月14日优先权日2005年3月17日发明者吉勒莫·科沃德-凯利,基思·A·麦考尔,马兹·P·T·史密斯申请人:诺维信北美公司