专利名称:生产干扰素的方法
本发明是关于生产干扰素的一种方法。
干扰素(下面有时缩写成“IFN”)是较高级动物细胞所生成的一种蛋白(朊)，该动物细胞引入病毒、或者与核酸、或者与促进细胞分裂剂一起来制备干扰素。这种干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和其他功能。
目前，已知人体IFN有三种不同特性的类型，即α、β和γ型。其中引入病毒的或者同核酸在一起的为α型和β型，引入促进细胞分裂剂的为γ型。因此通过培养人体细胞或者细胞系生产了人体干扰素，但生产量非常少，在大量地临床试验上或做为治疗药剂就不可能提供足够的人体干扰素。然而，近来基因培养技术的进展，使得α、β和γ型的生物活性蛋白能够从培养大肠杆菌、或者从一些其它含有一种表示媒介物(下称媒介物)的微生物来得到，该媒介物具有干扰素插入结构基因。〔Nature，284，316(1980);Nature，287 411(1980);Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(下面缩写成Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A)，77，5230(1980);Nucleic Acids Research，8 4057(1980);Nature，295 503(1982)〕。不过，这些方法做为人体干扰素生产的工业方法，从收率来看并不能令人满意。
由于这些情况，作者对培养微生物的方法，进行了深入的研究，研究培养了载有一个具有干扰素插入结构基因的媒介物的微生物。作者发现用这种方法所得到的干扰素有非常高的收率。该方法是从常用的介质中，选择一种特殊的化学规定介质(下简称为化学介质)来培养微生物。该介质中的有机氮源多数是天然产物。这个发现及进一步的研究，使本发明得以实现。
于是，本文提出了生产干扰素的一种方法，这种方法包括在含有L-谷氨酸和一个铁离子源的化学介质中，培养含有一个干扰素插入结构基因的媒介物的微生物，以及从培养基提取干扰素。
人体干扰素已知有α、β和γ三种类型，尤其众所周知的α型包括许多分子形式，例如对干扰素A、B、C、D、F、H、I和J编码的基因，已经报道是无性系的，并且以大肠杆菌来表示。(见European Patent Application Publication No.48970)。γ型干扰素基因(例如，见European Patent Application Publication No.77670)。也报导了以大肠杆菌表示。这些基因和其它人体干扰素的基因能以宿主微生物表示，并按照本专利生产干扰素。
有效的干扰素基因以宿主微生物表示，尤其是以大肠杆菌表示，COLEI衍生出PBR322〔Gene，2，95(1977)〕，对于媒介物PBR322常常做为质体，任何一个质体也可使用，只要它们在大肠杆菌中繁殖生长。这些例子是PBR313〔Gene，2 75(1977)〕，PBR324，PBR325〔Gene，4 121(1978)〕，PBR327，PBR328〔Gene，9，287(1980)〕，PKY2289〔Gene，3，1(1978)〕，PKY2700〔Seikagaku(Biochemistry)52，770(1980)〕，PACYC177，PACYC184〔Journal of Bacteriology，134，1411(1978)〕，PRK248，PRK646和PDF41〔Methodsin Enzymology，68 268(1979)〕。
而且由噬菌体衍生媒介物，如从入噬菌体〔Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，71 4579(1974)，λgt.λB〔Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，72 3416(1975)〕λDam〔Gene，1，255(1977)〕，黄热病病毒的各种媒介物〔Science，196，161(1977);Journal of Virology，29 555(1979)〕，衍生出λgt系列的λgt.λC。并且也可以使用丝状的噬菌体衍生出媒介物。
IFN结构基因优先和促进剂下端连接，有用的促进剂其中包括色氨酸(trp)促进剂、乳糖(lac)促进剂、蛋白链展长因子Tu(tuf B)促进剂、rec A促进剂，以及包括入噬菌体繁殖的λPL和λPR促进剂。使用任何一种促进剂都对所要求的杆菌的干扰素基因起促进作用。
可用已知方法生产具有干扰素结构基因的媒介物。例如对α型干扰素的制备叙述在
Nature，287，411(1980)，
DNA 1，125(1982)，
Nucleic Acids Research，11，2927(1983)
European patent Application Publication
No.43980，
对β型干扰素的制备方法叙述在
Nucleic Acids Research，8，4057(1980)
Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，77 5230(1980)，
Nucleic Acids Research，11 4677(1983)
European Patent Application Publication
No.48970
对γ型IFN的制备方法叙述在
Nature，295，503(1982)
European Patent Application Publication
No.77670
Japanese Laid-open Patent Application Laid-open No.189197/1983
Japanese Laid-open patent Application
No.176090/1983(Japanese Laid-open patent
Application No.186995/1984，European patent
Application Publication No.110044)
Japanese patent Application No 45723/1983
(Japanese Laid-open patent Application
Laid-open No 169494/1984)，可参考这些资料。
宿主微生物进入干扰素插入一个结构基因的媒介物的使用，也可使用大肠杆菌，从使用和安的观点，则宁可使用大肠杆菌K-12-衍生的菌种，大肠杆菌K-12-衍生的菌种包括大肠杆菌菌种294，W3110，C-600，和X1776。这些菌种的突变体也可使用。
上面的菌294报导在Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，73，4174(1976)中，这种菌种编入The American Type Cul-ture Collection(以下缩写成ATCC)Catalogue of Strains I，15 th edition 1982，在ATCC 3144里面。在European patent Application publication No.89676进一步做了报导。
上面菌种W3110，报导在ATCC Catalogue of`Strains I，15th edition 1982，在ATCC 27325里面。
上面菌种C-600报导在ATCC Catalogue of Strains I，15th edition 1982，在ATCC 23724里面。
上面菌种X1776，报导在Journal of Infectious Diseases，137，668(1978)
U.S.P.4190495并称为ATCC 31244(编入ATCC Catalogue of Strains I，15th edition，1982)。
引进具有干扰素插入结构基因的媒介物(质体媒介物或者噬菌体媒介物)进入宿主生物体里，可用一般的方法生产。例如报导入
JOurnal of Molecular Biology，53，159(1970)
Methods in Enzymology，68，253(1979)
Gene，3，279(1978)，可用以参考。
实际上本发明用的化学介质全部组成是已知的，本文的介质包含一个由L-谷氨酸和铁离子源组成的基础介质，而其它更好的配方在下面加以叙述之。
主要由无机盐组成的那些已知介质，可以采用上述化学基础介质，这些无机盐用来保证细菌的繁殖，当用无机盐时，要和适宜的碳源和氧化一起使用。基础介质包括M-9(见表1)和Davis介质(见表2)，由无机盐组成的TSM-3列于表3中，该介质使用更为有利。按照本文L-谷氨酸和铁离子源及其它更好的物料将在下面讨论。
表1 M-9介质
Na2HPO46克/升
KH2PO43克/升
NaCl 0.5克/升
NH4Cl 1克/升
MgSO4·7H2O 0.34克/升
表2
Davis介质
K2HPO47克/升
KH2PO43克/升
(NH4)2SO41克/升
柠檬酸冰合物 0.5克/升
表3
TSM-3介质
KH2PO41.5克/升
K2HPO41.0克/升
(NH4)2SO41.25克/升
MgSO4·7H2O 3.5克/升
表4
SS-1介质
葡萄糖 5克/升
(NH4)2SO45克/升
KH2PO41.5克/升
Na2HPO4·12H2O 8.4克/升
NaCl 5克/升
MgSO4·6H2O 3.4克/升
L-谷氨酸钠 2克/升
FeCl3·6H2O 27毫克/升
按照本文使用的L-谷氨酸，也可以是盐的形式，生理上能够允许的盐如钠盐、钾盐或铵盐，所说的L-谷氨酸或盐，一般加入量约为0.1-10克(对L-谷氨酸而言)，更好为化学介质的1-5克/升。
实际上本文使用的铁离子源是一个当溶解后能够提供铁离子源的物质，或者是溶解后以铁离子的形式可利用的物质。例如上面提到的铁离子源可以是氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、磷酸亚铁、硝酸亚铁、柠檬酸亚铁和乳酸铁。铁离子源的加入量为化学介质的10-5-10-3克分子/升(对铁离子而言)，更好是5×10-5-5×10-4克分子/升。
按照本文的方法，在化学介质中加入一个锌离子源，一个铜离子源，或者两者同时加入更为有利，因为它能够增加所需求的产品的产率。
上述锌离子源是一个当溶解后能够提供锌离子的物质，或者溶解后以锌离子的形式可被利用的物质。例如所说的锌离子源可以是氯化锌、碱式碳酸锌、硝酸锌、硫酸锌和磷酸锌，其锌离子源在化学介质中的加入量约为10-5-10-3克分子/升(对锌离子而言)，最好是2×10-5-1×10-4克分子/升。
上述铜离子源是一个当溶解后能够提供铜离子、或者溶解后以铜离子形可被利用的物质，例如铜离子源可以是硫酸铜、氯化铜、氯化亚铜、碳酸铜和醋酸铜。其铜离子源在化学介质中的加入量大约是10-5-10-3克分子(对铜离子而言)，最好是2×10-5-1×10-4克分子/升。
当宿主微生物是一个氨基酸-营养缺陷型时，要求适当的加入一种氨基酸或多种氨基酸(如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸)，每一种加入量大约是10-1000毫克/升。对维生素来说，除了维生素突变体使用之外，一般的维生素(如泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌甙醇、烟酰胺、盐酸维生素B6、B2和B1)并非是必需的。但是加入1-100毫克/升的维生素B1，有利于发酵过程的平稳。因此可适当地加入。当宿主有机体需要一种维生素或多种维生素时，每一种加入量为1-100毫克/升。
当宿主微生物需要核酸有关化合物或其它化合物时，所需要的化合物可以加到培养基中，每一种加入量大约为1-100毫克/升。
碳源加入其介质中，有利于全部诱导期保持约在0.1-5%(W/V)的浓度，因为这个方法可使所期望的IFN大量累积。以上所说的碳源例如葡萄糖、甘油、麦芽糖和山梨糖醇。
对于一般带有选择标记的干扰素插入的，具有一个结构基因编码的质体(Plasmid也称为胞质遗传体)，这个质体包含一个阻抗特殊的抗生素的基因。在这种情况下，抗生素(如四环素、α-氨基苄青霉素)加到介质中是有利的。因为只有这样质体才能促进菌种的生长繁殖。
培养过程通常是在搅拌、氧化培养基中进行的。进行培养时，在介质中溶解氧的饱和浓度不低于5%(V/V)是有利的。因为在这种情况下，所需要的IFN的产率可以增加。为了这个目的，在培养过程中，要有效的补充空气或纯氧气。
根据本发明，进行培养时，介质需要调节PH值，一般PH约为5-7.5，培养的温度大约是15°-45℃，最好是20°-42℃。为了细胞繁殖生长，培养过程的最初温度控制在37℃±5℃，然后温度逐段降低或连续降低到最低温度约23℃±5℃。这样有利于增加干扰素的产率。初期温度更好是37℃±2℃。当细胞繁殖生长到20-40%时，温度降低到33℃±2℃;当细胞繁殖生长到40-60%时，温度降低到29℃±2℃;当细胞生长到60-75%时，温度降低到25℃±2℃;培养过程连续给出一定量的需要IFN。或者当细胞繁殖生长到75-90%时，温度降低20℃±2℃，仍然连续培养将得到大量需要的IFN。整个培养周期大约是3-72小时。
根据本文在发酵过程中，IFN通常聚集在微生物的细胞里，为了提取聚集在培养基里的干扰素，因此首先用离心方法或者过滤方法得到细胞，然后将IFN提取出来。干扰素提取方法可用超声波处理、溶菌酶处理，或者用化学方法处理，例如用表面活性剂处理。
可用蛋白和肽通常纯化的方法，例如用硫酸铵盐析、醇沉淀、离子交换色谱、纤维素柱色谱、或者凝胶过滤等方法来纯化上述方法提取的干扰素。特别是这样的方法与单元性系的抗体分离技术结合起来时，例如使用单无性系的抗体柱色谱，只选择吸附IFN，故这种方法能够得到很高纯度的产物。
例如从培养基中提取，可用离心方法，将上层清液经过一个单无性系的抗体柱，用0.2克分子醋酸、0.1%三硝基甲苯×100(聚乙二醇基-对-叔-辛基苯醚)和0.15克分子NaCl混合液进行冲洗，在这个步骤里，干扰素将按基特性在单无性系抗体柱上逐个被吸附。很容易得到高纯度的样品。〔关于α型IFN的纯化见Scientific American，243(4) 56 (1980) 关于γ型IFN的纯化，见Japanese Patent Application No 176091/1983，European PatentApplication publication No 103898〕。
用本专利技术生产人体白血球IFNαA蛋白，当测定抗病毒活性时，是用牛肾得到的MDBK细胞簇上的口腔泡疹病毒(VSV)的细胞病变效应的抑制作用试验测定的。所生产的蛋白可能化到比活性不低于108单位/毫克。该技术生产的人体免疫干扰素蛋白，对人体羊膜得来的WISH细胞簇用上述同样的方法检验，该蛋白可纯化到比活性不低于107单位/毫克。〔可参考 Japanese patent Application No 176091/1983
(European patent Application publication No 103898)〕。
按本文生产的人体干扰素，其物理化学性质和生物性质与常用的营养介质中培养的人体干扰素是相同的。
所以，为了同样的目的，能用本文的方法生产干扰素，并且同样也能用通常的方法生产干扰素。
IFN具有抗病毒、抗肿瘤、抗增生和具有免疫能力以及其它作用。所以可用它治疗哺乳动物(如人、牛、马、猪、鼠)的病毒传染、肿瘤等。采用IFN做为抗病毒、抗肿病、抗增生药剂或者做为免疫药剂。例如干扰素与本身已知的药理又允许的带菌体、赋形剂或者稀释剂混合，然后用于静脉注射或肌肉注射或者其它方法注入。每日注射量大约是10万-1万万个单位/人。除人之外，哺乳动物注射量2000-200万单位/公斤/天，最好是2万-100万单位/公斤/天。
下面的实例将进一步说明本发明。
实例1
葡萄糖做为碳源，按10克/升加入到上述的M-9介质或TSM-3介质中，该介质中可加入，也可不加入谷氨酸钠。用大肠杆菌294(ATCC 31446)/PLe IF A trp 25(European patent Application publication No 43980供参考)进行接种，接着在37℃下，培育繁殖16小时，检验菌种的繁殖其结果列于表5。
表5 L-谷氨酸钠对细菌繁殖的影响
实例2
一个5升的发酵罐装入2.5升的介质，该介质是由25克/升的葡萄糖和4克/升的L-谷氨酸钠加到TSM-3介质中而制备的。表6给出金属盐加到那里。该介质用50毫升大肠杆菌294(ATCC31446)/PLe IFAtrp 25菌种培养基进行接种，该菌种培养基载有一个具有人体白血球IFN-αA插入的结构基因的质体，接着在37℃，以1000rpm转速进行搅拌并在2.5升/分充气下培养。在培养过程中随着细菌的繁殖，温度逐步的由37℃降低到33℃、29℃和25℃。而且在培养中，当介质中葡萄糖浓度小于1%时，要加入新制的2.5%葡萄糖。培养过程需要27小时，并用氨水使PH值保持在6.8。细菌繁殖的情况和人体白血球干扰素αA的收率及结果如表6所示。
表6 微量金属盐对细菌繁殖和IFN生产的影响
注＊用Klett-Summerson el色计测定细菌混浊度。细菌繁殖的程度以相对增长值来表示的，它是以铁、铜、锌离子同时加入为100做基准的。
＊＊IFN的累积是根据抗病素活性测定的。产率是以相对值来表示，这是以铁、铜、锌离子同时加入为100做基准
实例3
制备菌种培养基是在200毫升锥形瓶中装入50毫升(A)惯用的营养基介质(L-肉汤)，如表7所示。和50毫升(B)含有L-谷氨酸源和铁离子源的SS-1介质，如表4所示，随后加入5毫克/升的盐酸四环素。这样的介质用大肠杆菌294(ATCC 31446)/PLe IF trp25接种，该大肠杆菌载有一种具有人体白血球IFN-αA插入的结构基因的质体，然后在37℃下培育孵化12-16小时。
表7 菌种培养基(L-肉汤)
在上述的TSM-3介质中，加入25克/升的葡萄糖、4克/升的L-谷氨酸钠，27毫克/升的FeCl3·6H2O，8毫克/升的CuSO4·5H2O，8毫克/升的ZnSO4·7H2O，70毫克/升的盐酸维生素B1和5毫克/升的盐酸四环素。然后在5升的发酵罐内装入2.5升的上面的介质，再用菌种培养基(A)和(B)进行培养，与实例2试验相同条件，细菌的繁殖和人体白血球IFN的检验与收率如表8所示。
表8 菌种培养基对干扰素生产的影响
注＊细菌的混浊度用Klett-Summerson比色计测定。细菌繁殖程度以相对增长值表示，这是以培育孵化18小时为100做基准。
＊＊IFN的累积是按抗病毒活性测定的。
收率是按照相对值表示的，其收率的比较是以L-肉汤介质
培育孵化18小时为100做基准的。
Y使用化学介质(SS-1菌种介质)为菌种培养基比L-肉汤培养基在发酵过程中增加细菌繁殖和IFN产率。
实例4
一个200毫升的锥形烧瓶中，装入50毫升的SS-1菌种培养基。然后再加入5毫升/升盐酸四环素。该介质用大肠杆菌294(ATCC 31446)/PLe IF A trp 25接种，该大肠杆菌载有一个具有人体白血球IFN-αA插入的结构基因的质体。培养是在37℃、16小时进行的。然后将4克/升的L-谷氨酸钠、27毫克/升的氯化铁、8毫克/升的硫酸铜、8毫克/升的硫酸锌、70毫克/升的盐酸维生素B1和5毫克/升的盐酸四环素加入到TSM-3介质。在一个5升的发酵罐中加入上面配制的介质，葡萄糖按表9所示加入到里面，然后用上面菌种培养基接种，培养是在2.5升/升充气下，以1000rpm转速搅拌，温度维持在37℃下开始的。随着细菌的繁殖，培养温度从37℃分步降到33℃、29℃和25℃。其中溶解氧的饱和浓度不低于10%，在培养期间用氨水调整PH值，使其保持在6.8，培养进行27小时。细菌的增殖和人体白血球IFN-αA的检验其结果如表9所示。
表9 葡萄糖浓度的影响
注＊细菌浊度用Klett-Summerson比色计测定，细菌增殖是以编号4-1为100时的相对值表示。
＊＊干扰素的累积是用抗病毒活性测定。
干扰素的产率以编号4-1为100时的相对值表示。
从表9可知在编号4-1、4-2和4-3条件下，细菌的增殖和IFN-αA的生成有明显的增加。
实例5
一个5立升的发酵罐装有2.5立升的(1)介质(培养基)，该培养基是由25克/升的葡萄糖、5克/升的酪蛋白氨基酸(Difco，U.S.A)，70毫克/升的盐酸维生素B1和5毫克/升盐酸四环素加到M-9介质所制备的。或(2)一个化学介质它是由25克/升葡萄糖，4克/升L-谷氨钠、27毫克/升FeCl3·6H2O，8毫克/升CuSO4·5H2O，8毫克/升ZnSO4·7H2O，70毫克/升盐酸维生素B1、5毫克/升盐酸四环素、50毫克/升的L-脯氨酸和50毫克/升的L-亮氨酸加到M-9介质所制备。分别用大肠杆菌(ATCC 31446)/PLe IF A trp 25接种。该大肠杆菌载有一种具有人体白血球IFN-αA插入的结构基因的质体(European Dotent Application Publicotion No 43980可参考)培养在2.5升/分吹气，1000rpm转速搅拌下，于37℃进行培养，在培养过程中温度逐步降低，当OD为3000ku时，温度降低到33℃。当OD为5000ku时，温度降到29℃，当OD为7000ku时，温度降到25℃。同样的，培养连续进行48小时，溶解氧的浓度保持不小于5%的情况下，但其间葡萄糖浓度降到1%或更低时，则以25克/升的速率加入葡萄糖，其结果如表10所示。
表10介质 人体白血球IFN的产率(1)营养培养基 100(2)化学介质 520
注＊IFN的累积按抗病毒活性测定的
IFN的产率按营养培养基作为100的相对值。
从表10中可以明看出，根据本发明加入多种化合物的化学介质(2)中，干扰素的产率显著增加。
离心在化学介质(2)中的2升培养基肉汤得到细胞簇，该细胞使其悬浮在100ml的50mM(毫克分子)的Tris-HCl溶液中(PH7.6)，其中还含有10%的蔗糖、0.2M NaCl，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10mM N-(3-氨基丙基)-1.4-丁二胺、2mM苯基甲基氟磺酸(PMSF)和0.2毫升/毫升的溶菌酶等。这个悬浮液在4℃下搅拌1小时，然后在37℃下保持5分钟，并且用近距离声波定位器(Altec，USA)在0°下处理40秒，该溶菌产物在11300×g下离心/小时得到95毫升的上层清液。
这个上层清液(95毫升)用20mM Tris-HCl(PH7.6)以及含1mM EDTA和0.15M NaCl(TEN)稀释到300毫升，该稀释溶液用于抗IFN-αA抗体柱(20ml)。
在用0.15M NaCl(TEN)很好地冲洗柱子后，用0.2M的乙酸并含有0.1% TWeen 20(Wako pure chemical Industries，Japan)进行洗脱，调节PH为4.5用羧甲基纤维素柱吸附活性组份，然后用含有0.15M Nacl的0.025M醋酸铵缓冲剂(PH5.0)很好的冲洗柱子和洗脱处理。活性组份再次经过上述处理后，并且在真空中的冷冻状态下蒸发水份，使其干燥可得到320毫克的人体白血球IFN-αA粉末。
SDS聚酰胺凝胶电泳分析测定出该产物分子量为19000±1000，最后得到的人体白血球干扰素蛋白的抗病毒活性是2×108U/毫克，就产品其它物理化学性质、氨基酸的组成和肽的变换而言，产品和常用介质所生产的人体白血球是一样的。
实例6
一个5升的发酵罐装入2.5升(1)的营养物介质，该介质是由25克/升的葡萄糖、20克/升酵母汁和5毫克/升的盐酸四环素加入到TSM-3介质所制成。或者装入(2)的化学介质，该化学介质是由25克/升葡萄糖、4克/升L-谷氨酸钠、27毫克/升的FeCl3·6H2O、8毫克/升CuSO4·5H2O，8毫克/升ZnSO4·7H2O、70毫克/升盐酸维生素B1和5毫克/升的盐酸四环素加到TSM-3介质中所制成的。在上述两种介质中分别用大肠杆菌294(IFO 14171)/PHIT·trp 2101接种，〔Japanese Patent Application No 176090/1983(Japanese Patent Application Laid-open No 186995/1984，European patent Application Publication No 110044)可参考〕这种大肠杆菌载有一种具有人体免疫IFN插入的结构基因的质体。在吹气速度2.5升/分搅拌速度1000rpm(转/分)和温度为37℃下开始培养，在培养的过程中，当OD达到2000klett单位时，温度要降为33℃，当OD达到4000klett单位时，温度降到29℃，当OD达到6000klett单位时，温度降到25℃，培养持续26小时，用氨水控制培养介质PH为6.8，同时在培养过程中，在介质中葡萄糖浓度低于1%时，加入25克/升的葡萄糖、结果，假定用营养物介质(1)制取的IFN-γ的产率做为100时，则用化学介质(2)的产率是550。
通过离心上述的2.4升化学介质培养物得到的细菌细胞，悬浮在120毫升50mM Tris-HCl(PH7.6)其中含有10%的蔗糖，10mM EDTA，10mM的N-(3-氨基丙基)-1.4-丁二胺，2mM的PMSF和0.2毫克/毫升的溶菌酶的溶液中。该悬浮物在4℃下搅拌1小时，随后在37℃下保持5分钟并用近距离声波定位器处理。该溶菌产物在11300×g下离心1小时得到115毫升的上层清液。
该上层清液(115ml)用TEN稀释到360毫升，这个稀释溶液用于抗-IFN-γ抗体柱(25ml)。
〔例12和13的Japanese patent Application No176091/1983(European patent Application Publi-cation No 103898)可供参考〕然后用TEN很好地冲洗柱子，用含有1M NaCl和0.1%Tween 20的20mM Tirs-HCl(PH7.0)进一步冲洗柱子，接着用含有2M盐酸胍的Tris-HCl(PH7.0)洗脱抗体柱，然后在含有0.115% Na2HPO4，0.02%KH2PO4，0.8% NaCl和0.02% KCl的缓冲液中于4℃，18小时下，活性组份(100ml)被渗析出。
按照这样的方式最后得到
47克，并具有抗病毒活性为2×107U/毫克的人体免疫的IFN蛋白。
获得的样品用SDS-聚酰胺电泳测定其分子量为18000±1000，就样品的其它物理化学性质、氨基酸的组成和肽的变换而言，样品和常用介质所生产的人体免疫IFN是一样的。
权利要求
1、生产干扰素的方法包括在含有L-谷氨酸和一个铁离子源的化学介质中，培养一种微生物，该微生物载有一种具有干扰素插入一个结构基因的表示媒介物。以及从培养基中提取干扰素。
2、按照权项1所述的化学介质中，还可再含有一个锌离子源。
3、按照权项1所述的化学介质中，还可再含有一个铜离子源。
4、按照权项2所述的化学介质中，还可再含有一个铜离子源。
5、按照权项1所述的干扰素结构基因是人体白血球干扰素的结构基因。
6、按照权项1所述的干扰素结构基因是人体免疫的结构基因。
7、按照权项1所述的介质中，含有L-谷氨酸，其浓度大约为0.1-10克/升和铁离子源其浓度大约为10-5-10-3克分子/升。
8、按照权项2所述的介质中，含有的锌离子其浓度大约为10-5-10-3克分子/升。
9、按照权项3所述的介质中，所含的铜离子浓度大约为10-5-10-3克分子/升。
10、按照权项4所述的介质中，所含的铜离子浓度大约为10-5-10-3克分子/升和所含的锌离子浓度大约为10-5-10-3克分子/升。
11、按照权项1所述的介质中，可再包括一个碳源，在培养过程中，其碳源浓度保持为介质的0.1-5%。
12、按照权项11所述的培养过程，其介质中氧的浓度保持在溶解氧饱和浓度不小于5%的水平。
13、按照权项1所述的培养过程，开始时温度在37℃±5℃，随细胞繁殖而降低温度，最终为23℃±5℃。
专利摘要
本文报道了高收率生产干扰素的一种方法。该方法包括在含有L-谷氨酸和铁离子源，最好还含有锌离子源，或锌和铜离子源的化学规定介质中培养载有一种具有干扰素插入的结构基因的表示媒介物的微生物，以及从培养基中提取干扰素。
文档编号C12N1/20GK85102303SQ85102303
公开日1986年9月17日 申请日期1985年4月1日
发明者北野一昭, 藤本茂 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan