专利名称：人α2b型干扰素的基因合成、表达质粒构建及产物的制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用基因工程技术实现大量生产人α2b型干扰素的方法人α2b型干扰素作为重要的生物高科技产品，是治疗乙肝、丙肝等病毒性疾病和恶性肿瘤的重要药物。在我国，干扰素的生产工艺复杂，产量偏低，成本较高，还不能为广大工薪阶层广泛接受和使用，影响了干扰素的产业化进程，因此大幅度降低其生产成本是当前干扰素开发中的一项重要任务。
人α2b型干扰素当前存在生产成本高的问题，其主要原因是表达水平偏低，干扰素蛋白的表达只占菌体可溶性蛋白的1-2％；干扰素成品的获得需经历多重复杂的纯化工艺流程，纯化损失大，回收率只有10-20％。
对本发明通过全基因分段合成和PCR拼接，构建了全人工合成的人α2b型干扰素基因，利用原核表达载体pBV220和pWT7在大肠杆菌DH5α中以包涵体形式获得高效表达，并建立了一整套简便有效的纯化人α2b型干扰素的工艺流程，提高了干扰素的表达量和最终得率。人α2b型干扰素的表达量达到菌体可溶性蛋白的20％，干扰素α2b的最终产量可提高数十倍，大幅度降低了干扰素制剂的成本。全人工合成高产廉价人α2b型干扰素的研制成功，将带来干扰素产业的更新换代，具有巨大的社会效益和经济效益，造福广大人民。
以下对本发明进行详细描述。1．人α2b型干扰素基因DNA序列的设计通常的技术改进手段，如上游表达载体的优化、下游工程中表达与纯化工艺的改良等，对干扰素的表达量与最终得率的提高的效果均不明显。本发明从影响异源蛋白在大肠杆菌中表达水平的另一重要影响因素---基因的密码子构成入手，对人α2b型干扰素基因进行了全面的设计与合成。
同一种氨基酸乃至蛋白质多肽分子，根据密码子的简并性，可由不同的DNA序列来编码。不同生物种对蛋白质的编码基因的密码子的喜好性是不同的，现有的人α2b型干扰素基因的DNA序列是自正常人白细胞经新城疫病毒诱导后克隆而来，其密码子构成体现了人对编码蛋白质的密码子喜好性，将这种DNA序列通过载体由大肠杆菌来表达，因此得到很低的表达水平。采用大肠杆菌的喜好密码子来替代天然密码子，是提高干扰素的可行手段。
本发明根据各种密码子的在大肠杆菌中的使用频率，保留人α2b型干扰素的氨基酸序列不变，选用在大肠杆菌的喜用密码子，取代原有人α2b型干扰素基因DNA序列中的非喜用密码子，设计全新的人α2b型干扰素基因DNA序列。人α2b型干扰素的氨基酸序列、天然基因及合成基因的序列见附图
k2．人α2b型干扰素基因的全人工合成根据所设计的DNA序列，采用全基因分段合成和PCR拼接的策略，构建人工合成的人α2b型干扰素基因。2．1 在通用的DNA自动合成仪上采用亚磷酸酰胺法化学合成以下7段长度为90bp左右的DNA片段，编号分别为L1,L2,L3,R1,R2,R3和R4。其中L1的5‘端含EcoR1位点，R4的3’端含BamH1位点，以便向表达载体插入。
序列中的阴影部分，表示该处是两段DNA片段互补搭接之处。2．．2利用PCR反应体系，搭桥法分步延长合成的IFNα2b基因片段。2．2．1 DNA片段L3,R4的链延长反应根据设计，L3与R4的末端有20个碱基互补，这使两链相连，在PCR反应体系中，两链未互补部分互为模版发生链延长。反应条件L3 5μL(0.10D/μL),R45μL(0.10D/μL),10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)16μL,H2O 63μL，反应体系共100μL。94℃恒温5min，55℃恒温加入TaKaRa LATaq酶1μL后，恒温5min,72℃,5min.即可得到由L3和R4拼接而成的两条互补长链，名为L3R4，为下一步PCR反应的模版。2．2．2 DNA片段L2,R3的链延长反应与前一步同理，依据设计，L2与L3有20bp的互补序列，R3与R4有20bp的互补序列。利用引物L2和R3进行如下的PCR反应，反应条件L2(0.01 OD/μL)1pL,R3(0.01 0D/μL)1μL,模板L3R4 1μL,10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)10μL,TaKaRa LA Taq酶1μL,H20 76μL，反应体系共100μL,94℃,30s,55℃30s,72℃,30s，共30循环。产物名为L2L3R4R3，为下一步PCR反应的模版。2．2．3 DNA片段L1,R2和R1的链延长反应依据设计，L1与L2有20bp的互补序列，R2与R3有20bp的互补序列，R1与R2有20bp的互补序列。利用引物L1,R2和R1进行如下的PCR反应，反应条件L1(0.01 OD/μL)1μL,R2(0.01 OD/μL)1μL,R1(0.01 OD/μL)1μL，模板L2L3R4R3 1μL,10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)10μL,TaKaRaLA Taq酶1pL,H2O 75μL，反应体系共100μL,94℃,30s,55℃30s,72℃,30s，共30循环。产物名为L1L2L3R4R3R2R1，即为合成的全长的人IFN α2b基因(命名为sIFNα2b)。3．全人工合成的人α2b型干扰素基因的克隆和表达3．1全人工合成的人α2b型干扰素的表达载体pSI9903的构建及表达(实例说明)用EcoR1和BamH1完全酶切全长的人IFNα2b基因，插入经EcoRⅠ,BamHⅡ双切的pBV220原核表达载体中，获得重组质粒pSI9903，转化大肠杆菌DH5α，所选转化克隆经PCR、酶切鉴定和DNA序列测定证明克隆正确。阳性克隆37℃过夜活化后，按1∶100比例转接共5ml含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养至OD=1，转42℃继续培养6小时，离心收集菌体，加入100ul 2X上样缓冲液，100℃煮沸5min,12％SDS-PAGE电泳检测干扰素表达，经凝胶扫描分析，干扰素表达量达到菌体蛋白的30％，比原有菌种的表达水平提高了10倍以上。附图2为pSI9903的质粒构建图。附图3为表达菌体的12％SDS-PAGE电泳图。3．2全人工合成的人α2b型干扰素的表达载体pSI9904的构建及表达设计一对两端具NdeⅠ与BamHⅠ酶切位点的PCR引物，利用PCR反应自pSI9903中得到人α2b型干扰素基因，用Ndel和BamH1完全酶切PCR产物，插入经NdeⅠ,BamH Ⅰ双切的pWT7原核表达载体中，获得重组质粒pSI9904，转化大肠杆菌BL21，所选转化克隆经PCR、酶切鉴定和DNA序列测定证明克隆正确。阳性克隆37℃过夜活化后，按1∶100比例转接共5ml含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600=1，加入IPTG至终浓度为4mM 25℃继续培养6小时，离心收集菌体，加入100ul 2X上样缓冲液，100℃煮沸5min,12％SDS-PAGE电泳检测干扰素表达，经凝胶扫描分析，干扰素表达量达到菌体蛋白的30％，比原有菌种的表达水平提高了10倍以上。附图4为pSI9904的质粒构建图。附图5为表达菌体的12％SDS-PAGE电泳图。4 全人工合成的人α2b型干扰素的大量表达及纯化(实例说明)将工程菌单菌落挑入5mL含50/mL氨苄的LB培养基中，37℃培养过夜，次日转至500mL含50μg/mL氨苄的LB培养基中，37℃培养至其进入对数生长期，转入5升发酵罐中，37℃培养至其OD=1，快速升温至42℃，诱导6小时，离心收菌。菌体湿重可达50g。
离心收集发酵的菌体经TE缓冲液洗涤后，溶菌酶、8M盐酸胍处理后，超声破菌，3500g离心得到包涵体，以7M尿素在4℃悬浮包涵体，继以8M盐酸胍裂解包涵体，PBS复性。透析去除盐酸胍后，离心取上清，过单抗柱，得到电泳纯的半成品，加入稳定剂后分装为成品。5．结果及产物活性测定由于工程菌种的成功改造，在同样的成本投入条件下，人α2b型干扰素的产量是原有菌种的十倍以上；换而言之，获得同样产量的人α2b型干扰素，由于更换新菌种，其成本降为原来的十分之一以下。
经蛋白质N端测序，结果证实纯化蛋白为人α2b型干扰素。将纯化的人α2b型干扰素半成品经蛋白定量后，以国际上通用的WISH/VSV系统测定比活为1×108IU/mg，与标准的人α2b型干扰素比活一致。
权利要求
1．一种重组人α2b型干扰素的全人工合成的基因，其特征在于DNA序列如下ATG TGT GAC CTG CCG CAG ACC CAC TCT CTG GGT TCT CGT CGT ACC CTGATG CTG CTG GCT CAG ATG CGT CGT ATC TCT CTG TTC TCT TGC CTG AAAGAC CGT CAC GAC TTC GGT TTC CCG CAG GAA GAG TTC GGT AAC CAG TTCCAG AAA GCT GAA ACC ATC CCG GTT CTG CAC GAA ATG ATC CAG CAG ATCTTC AAC CTG TTC TCT ACC AAA GAC TCT TCT GCT GCT TGG GAC GAA ACCCTG CTG GAC AAA TTC TAC ACC GAA CTG TAC CAG CAG TTG AAC GAC CTGGAA GCT TGC GTT ATC CAG GGT GTT GGT GTT ACC GAA ACC CCG CTG ATGAAA GAA GAC TCT ATC CTG GCT GTT CGT AAA TAC TTC CAG CGT ATC ACCCTG TAC CTG AAA GAA AAG AAA TAC TCT CCG TGC GCT TGG GAA GTT GTTCGT GCT GAA ATC ATG CGT TCT TTC TCT CTG TCT ACC ACC CTG CAG GAATCT CTG CGT TCT AAA GAA
2．根据与权利要求1的人α2b型干扰素的全人工合成的基因DNA序列有90％以上的同源性的DNA序列，含有与所述DNA序列有90％以上的同源性的DNA序列的相应的表达载体质粒，含有与所述DNA序列有90％以上的同源性的DNA序列的相应的宿主细胞包括细菌、酵母细胞、昆虫以及哺乳动物细胞。
3．七种重组人α2b型干扰素的全人工合成的基因片段，其特征在于DNA序列如下L1 CGGAATTCATGTGTGACCTGCCGCAGACCCACTCTCTGGGTTCTCGTCGTACCCTGATGCTGGTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCTCTGTL2 GATGCGTCGTATCTCTCTGTTCTCTTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAGTTCGGTAACCAGTTCCAGAAAGCTGAAL3 ACCAGTTCCAGAAAGCTGAAACCATCCCGGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCTCTACCAAAGACTCTTCTGCTGCTTGGR1 CGGGATCCTTATTCTTTAGAACGCAGAGATTCCTGCAGGTTGGTAGACAGAGAGAAAGAACGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCAAR2 CAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGAGAGTATTTCTTTTCTTTCAGGTACAGGGTGATACGCTGGAAGTATTTACGAACAGCCAGGATAGAR3 TTACGAACAGCCAGGATAGAGTCTTCTTTCATCAGCGGGGTTTCGGTAACACCAACACCCTGGATAACGCAAGCTTCCAGGTCGTTR4 ACGCAAGCTTCCAGGTCGTTCAACTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTGTCCAGGGTTTCGTCCCAAGCAGCAGAAGACTCTTTGG
4．根据与权利要求3的人α2b型干扰素的全人工合成的基因片段90％以上的同源性的DNA序列，含有与权利要求3的人α2b型干扰素的全人工合成的基因片段有90％以上的同源性的DNA序列的相应的表达载体质粒，含有与所述基因片段有90％以上的同源性的DNA序列的相应的宿主细胞包括细菌、酵母细胞、昆虫以及哺乳动物细胞。
5．含有权利要求1的人α2b型干扰素的全人工合成基因的表达质粒pSI9903。其特征为将权利要求1的人α2b型干扰素的全人工合成基因克隆入带有pLpR启动子Cits857温控阻遏蛋白的基因、核糖体5SrRNA基因中止信号t1t2及MCS区的基因载体pBV220中，构建成人α2b型干扰素的表达质粒pSI9903，转化大肠杆菌后获得高效表达；转化后的工程菌为大肠杆菌Escherichia coli(DH5α)，保藏编号CGMCC No.0428.1(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
6．含有权利要求1的人α2b型干扰素的全人工合成基因的表达质粒pSI9904。其特征为将权利要求1的人α2b型干扰素的全人工合成基因克隆入带有T7启动子，T7中止子的及MCS区的基因载体pWT7中，构建成人α2b型干扰素的表达质粒pSI9904，转化大肠杆菌后经IPTG诱导获得高效表达；转化后的工程菌为大肠杆菌Escherichia coli(BL21/DE3)，保藏编号 CGMCC N0.0428.2(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中)。
全文摘要
人α2b型干扰素是一种基因工程新药,是目前临床上用于治疗病毒性疾病和恶性肿瘤的重要药物,具有很高的市场价值。本发明基于提高人α2b型干扰素产量和降低市场价格的目的,设计合成了由大肠杆菌喜用密码子组成的人α2b型干扰素基因,并构建了带有该基因的表达质粒,在大肠杆菌中高效表达,表达量达菌体总蛋白的30%。这为大量生产人α2b型干扰素,造福人民创造了优越的条件。
文档编号C12N15/19GK1299872SQ9912596
公开日2001年6月20日 申请日期1999年12月10日 优先权日1999年12月10日
发明者魏开坤, 马学军, 张丽兰, 侯斌, 侯云德 申请人:病毒生物技术国家工程研究中心