专利名称：一种鸡α干扰素的生产方法及构建的工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程菌株的构建方法；更具体地说，本发明涉及一种鸡α干扰素 的生产方法及构建工程菌。
背景技术：
干扰素具有广谱抗病毒作用，由多种氨基酸组成，在ρΗ2 10时比较稳定，对热比 较稳定，为干扰素制品的研制提供了良好的条件。在干扰素家族中，α-干扰素的抗病毒作 用最为显著，是目前市场上的主流干扰素产品。利用基因工程技术研制重组干扰素是一条 高效而经济的途径。随着禽类保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种禽类干扰 素的研究成为近年来的研究热点。目前，实验室用于表达目的蛋白的质粒载体有pBS、pET系列和pMAL系列等载体， 诱导方式有温度诱导、IPTG诱导和乳糖诱导等。在大肠杆菌(E.coli)表达系统中，许多 外源蛋白的高水平表达都会导致形成包涵体，包涵体是细菌表达的蛋白在细胞内凝集，通 过低速离心可以分离出这些包涵体。由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，必须对其 进行变性和复性才能恢复其生物学活性。自1994年Sick等首先报道了鸡α干扰素基因 (GGIFN-α )，并在大肠杆菌(E.coli)和COS细胞中表达后，鸡α干扰素(ChIFN-α)和鸡 Y干扰素(ChIFN-Y)基因相继得到克隆，并在原核表达载体中获得表达，表达的产物为包 涵体型。外源基因在大肠杆菌宿主中的过量表达时，常常导致表达产物在胞内形成不溶性 的聚集体，即包涵体形成。包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，需要进行变性和复性才能 恢复其活性。防止形成包涵体的一个方法是用含有原核信号肽的载体进行表达。信号肽对 蛋白质的定位有着非常重要的作用，根据研究报道，适当改造信号肽结构可提高外源蛋白 的分泌效率。信号肽能够引导IFN-a通过细胞膜而分泌到细胞外，新合成的蛋白被转运 到周质空间，在周质空间中新合成的蛋白是可溶的，然后信号肽通过蛋白分解，保留成熟的 IFN蛋白，这种方法对真核分泌蛋白尤为有效。L-天(门)冬酰胺酶iKL-asparaginase， 简称ASP)信号肽是一种外周胞质酶，分析编码这种酶的ansB基因显示该酶在它的氨基酸 末端包含了一种典型的22个碱基的分泌型信号肽，当这种酶被分泌到细胞周质时，信号肽 就被清除同时产生一种含N末端的成熟蛋白亮氨酸，这种特性表明ASP信号肽能够被用来 直接分泌表达大肠杆菌中的活性干扰素。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种鸡α干扰素的生产方法；本发明的另一目的是提供一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌。本发明的目的按照下述方案实现一种鸡α干扰素的生产方法，其工艺过程为首先将获得细菌信号肽L-天(门) 冬酰胺酶II基因序列插入携带鸡α干扰素成熟蛋白基因序列的pET-28a(+)载体中，得到
3能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌；再在LB培养液中，370C，200rpm培养4 8h，加IPTG 至终浓度为lmmol/L，37°C，180rpm继续在TEM培养液中培养2 6h ；所得菌液经进一步分 离处理得到鸡α干扰素产品；所述菌液的分离处理过程为将菌液移到离心管中，在冰上低温超声破碎， 2 8 °C高速离心30min，收集沉淀；沉淀用含0. 5% TritonX-IOO和IOmM EDTA的PBS Buffer (pH7. 0 7. 4)洗涤1 3次；将沉淀悬浮于PBS buffer，加甘油冻存；所述菌液的分离处理过程为菌液进入冷冻干燥机，冷冻干燥20h以上；一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，该工程菌已提交到中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC3800 ；所述的能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其重组表达载体由以下元件构成1)鸡α干扰素成熟蛋白基因序列；2)细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II基因序列；3)pET-28a(+)；所述鸡α干扰素工程菌分泌表达的过程为首先通过PCR获得编码鸡α干扰素 成熟蛋白和细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II的基因序列，连接在pET28a(+)的多克隆 位点的下游，构建出表达载体；再将其转化到基因工程大肠杆菌表达细菌中，在TEM的培养 液中诱导表达。本发明提高了鸡α干扰素基因目的蛋白的表达效率，属国内首次采用在包涵体 型重组表达质粒pET-28a-ChIFN-a前加入一段L-天(门)冬酰胺酶II(ASP)信号肽基 因，重新改造构建成分泌型表达载体，使其得到改善，省去了 pET-28a-ChIFN-a表达形成 包涵体后的变性、复性提纯过程，并实现了诱导表达。ASP信号肽在重组表达载体中的考察 结果表明，ASP信号肽可使重组质粒经人工改造后，由目的蛋白包涵体型表达转变为分泌型 表达，并且提高了鸡α干扰素成熟蛋白基因的表达效果，这为筛选出鸡α干扰素成熟蛋白 的高效表达菌株奠定了基础。
图1 构建的ASP-ChIFN-α基因工程菌株示意图。图2 重组质粒pET-28a_ChIFN- α的酶切鉴定。图中 1，2 :pET-28a-ChIFN_a digested by EcoR I and Sal I ；M :DL2000 DNAMarker图3 重组质粒pET-28a-ASP_ChIFN- α的酶切鉴定。图中 1，2 :pET-28a-ASP-ChIFN- α by EcoR I and Nco I ；M :DL2000 DNA Marker图 4 重组质粒 pET-28a_ASP-ChIFN- α 的 SDS-PAGE 和 Western-blot 结果。图中 1 induced BL21 ；2，6 induced pET_28a_ChIFN-α ；3 :non-inducedpET_28a ； 4 :non-induced pET_28a_ChIFN-α ；5 :non-inducedpET-28a-ASP_ChIFN-α ；7 : induced 3h pET-28a/ASP-ChIFN-a ；8:induced 6hpET_28a/ASP_ChIFN-α ；9 :western_blot result；M :protein marker。
具体实施例方式1.材料大肠杆菌JM109、BL21 (DE3)、DH5 α (pMD18T)、质粒 pET_28a(+)为本实验室保藏； 连接酶、限制性核酸内切酶 EcoR I(15U/yL)、Nco I(10U/yL)、sal I(15U/yL)、Ex Taq DNA聚合酶(5U/ μ L)等购自takara有限公司；DNA回收试剂盒购自Promega公司；其余试 剂均为国产纯；引物Pl 为 5， -cttgaattctgcaaccaccttcgcc-3',P2 为 5， -caggtcgacctaagtgcgcgtgttgcct-3‘；P3 为 5， -cgccat￡gagtttttcaaaaag-3',P4 为 5，-ggaattctgccaatgctgcacc-3‘；由上海生工公司合成。2.步骤第一步屮0 扩增？0^^目的片断利用引物PI、P2，采用25 μ L，以提取的鸡肝组织基因组DNA为模板，进行PCR反 应；PCR仪程序设定为94°C变性4min ；94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸lmin，扩增 32个循环；72°C延伸IOmin。第二步=ChIFNa克隆载体的构建采用EcoR I和Sal I双酶切PCR扩增的ChIFN α目的片断，按照Wizard SVGel and DNA PCR Clean-up System说明书回收ChIFNα酶切片断，将回收产物与相应酶切回收 的pMD18-T载体按3 1比例连接，4°C过夜，连接产物采用CaCl2法转化到大肠杆菌JM109 感受态细胞中，小提质粒酶切鉴定并测序。第三步PCR扩增ASP目的片断利用引物P3、P4，采用25 μ L，以提取的大肠杆菌基因组DNA为模板，进行PCR反 应；PCR仪程序设定为94°C变性4min ；94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸30sec，扩 增30个循环；72°C延伸IOmin。第四步ASP克隆载体的构建采用Nco I和EcoR I双酶切PCR扩增的ASP目的片断，按照Wizard SV Gel andDNA PCR Clean-up System说明书回收ChIFN α酶切片断，将回收产物与相应酶切回收 的pMD18-T载体按3 1比例连接，4°C过夜，连接产物采用CaCl2法转化到大肠杆菌JM109 感受态细胞中，小提质粒酶切鉴定并测序。第五步鸡干扰素原核表达载体的构建分别用EcoR I和Sal I双酶切克隆载体pMD18_T_ChIFN α获取ChIFNa酶切片 断，按照 Wizard SV Gel and DNA PCR Clean-up System 说明书进行 ChIFNα 酶切片断的 回收，将酶切片断与EcoR I和Sal I双酶切处理的pET_28a(+)回收片段按4 1比例连 接，4°C过夜，连接产物经CaCl2法转化到大肠杆菌DH5 α和表达菌BL21 (DE3)感受态细胞 中，提取质粒酶切鉴定，将酶切正确的表达载体命名为pET-28a-ChIFNa。第六步重组ASP-ChIFN-α表达体系的构建分别用Nco I和EcoR I双酶切表达质粒pMD18_T_ASP获取ASP酶切片断，按照 Wizard SV Gel and DNA PCR Clean-up System说明书进行ASP酶切片断的回收，将酶切片 断与Nco I和EcoR I双酶切处理的pET-28a-ChIFNa回收片段按4 1比例连接，4°C过夜，连接产物经CaCl2法转化到大肠杆菌DH5 α和表达菌BL21 (DE3)感受态细胞中，提取质 粒酶切鉴定，将酶切正确的表达载体命名为pET-28a-ASP_ChIFN α。按照CaCl2法制备大肠 杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将pET-28a-ASP-ChIFNa转入BL21(DE3)感受态细胞，同时进 行对照质粒的转化、抗性(Kan)筛选，挑选菌落利用试剂盒提取质粒进行酶切鉴定、PCR检 测等。将正确构建的菌株命名为BL21 (DE3) (pET-28a-ASP-ChIFN- α )。第七步ASP_ChIFN α融合蛋白的诱导表达无菌状态下，LB培养液添加Kan至终浓度为10 μ g/mL，调整pH为7. 0 7. 2， 370C，200rpm 培养 BL21 (DE3) (pET-28a_ASP-ChIFN- α )，4 8h，力口 IPTG 至终浓度为 0. 1 1. 5mmol/L, 37 °C，180rpm 继续培养 2 8h。第八步重组ChIFN α蛋白的粗提将诱导表达后的菌液IOOmL转移到离心管中，4°C超声破碎(200W，50%振幅，间 歇5s，破碎2s，共20min)，4°C，12000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀；沉淀用含0. 5 % TritonX-IOO 和 IOmM EDTA 的 PBS Buffer (pH7. 0 7. 4)洗涤 1 3 次；将沉淀悬浮于 PBS buffer，加甘油冻存。或者将裂解的上清，进入冷冻干燥机，冷冻干燥20h以上。
权利要求
一种鸡α干扰素的生产方法，其工艺过程为首先将获得细菌信号肽L 天(门)冬酰胺酶Ⅱ基因序列插入携带鸡α干扰素成熟蛋白基因序列的pET 28a(+)载体中，得到能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌；再在LB培养液中，37℃，200rpm培养4～8h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，180rpm继续培养2～6h；所得菌液经进一步分离处理得到鸡α干扰素产品。
2.如权利要求1所述的鸡α干扰素的生产方法，其特征在于所述菌液的分离处理过程 为将菌液移到离心管中，2 8°C，低温超声破碎，2 8°C高速离心30min，收集沉淀；沉淀 用含 0. 5% TritonX-IOO 和 IOmM EDTA 的 PBS Buffer (pH7. 0 7. 4)洗涤 1 3 次；将沉 淀悬浮于PBS buffer，加甘油冻存。
3.如权利要求1所述的鸡α干扰素的生产方法，其特征在于所述菌液的分离处理过程 为菌液进入冷冻干燥机，冷冻干燥20h以上。
4.一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，该工程菌已提交到中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC3800。
5.如权利要求4所述的能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其特征在于其重组表达载 体由以下元件构成1)鸡α干扰素成熟蛋白基因序列；2)细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II基因序列；3)pET-28a⑴。
6.如权利要求4所述的能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其特征在于其分泌表达的 过程为首先通过PCR获得编码鸡α干扰素成熟蛋白和细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶 II的基因序列，连接在pET28a⑴的多克隆位点的下游，构建出表达载体；再将其转化到基 因工程大肠杆菌表达细菌中，在TEM的培养液中诱导表达。
全文摘要
本发明提供了一种鸡α干扰素的生产方法及其构建的工程菌，其工艺过程为首先将获得细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II基因序列插入携带鸡α干扰素成熟蛋白基因序列的pET-28a(+)载体中，得到能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌；再在LB培养液中，37℃，200rpm培养4～8h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，180rpm继续培养2～6h；所得菌液经进一步分离处理得到鸡α干扰素产品。本发明还提供了一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其分泌表达的过程为首先通过PCR获得编码鸡α干扰素成熟蛋白和细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II的基因序列，连接在pET28a(+)的多克隆位点的下游，构建出表达质粒；再将其转化到基因工程大肠杆菌表达细菌中，在常规的培养液中诱导表达。
文档编号C12N15/63GK101948890SQ20101018770
公开日2011年1月19日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者周学章, 宋振威, 王玉炯, 贾芳 申请人:宁夏大学