专利名称:培养原生质体的方法
本发明讲的是一种培养原生质体的方法。更明确地是本发明讲的是在一种液体介质中培养原生质体的方法，利用这种方法从原生质体衍生出一种愈伤组织或细胞簇。
原生质体是植物、细菌、真菌等等的脱去细胞壁的细胞。因为原生质体没有细胞壁，它易于受到诸如细胞融合、基因控制及人工体细胞突变这样的人工操作。这样，假如一种完全植物可由被操作的原生质体再生，那么得到一种具有野生型植物所没有的有利的特性的植物将是可能的。一种完全植物可由愈伤组织或细胞簇再生，这对许多植物来说都是已知的。这样，如果一种愈伤组织能由原生质体衍生出来，一株完全植物看来能由愈伤组织再生，依次地能由原生质体再生。
对于象烟草这样的双子叶植物，有些技术是已知的，一种完全植物可用这些技术从原生质体再生出来。但对象稻子、小麦和玉米这样的禾本科植物，据报导仅有玉米和牧草能再生完全植物。至于稻子很少数的技术已有报导如下所述。原生质体的常规培养方法包括把原生质体埋在半固体琼脂介质中，把原生质体悬浮在液体介质中以及用喂养细胞来培养原生质体的原生质体培养法。但是，已经发现这些技术对培养其它植物象稻子、小麦和玉米的禾本科植物常常没有什么效果。例如，如果稻子的原生质体用这些方法中的一种来培养，原生质体就死亡或不生长。
至于稻子的原生质体的培养技术已有报导，由缺乏其硝酸盐还原酶的细胞得到的一种原生质体衍生出来一个愈伤组织(Wakasa等，J.Plant Physiol，117PP223-231(1984))，一个苗是由一种愈伤组织再生来的，这种愈伤组织是由花粉的愈伤组织得到的原生质体衍生来的(Ohno等，Japanese Journal Of Breeding 35PP54-55(1985))。然而，这些技术利用从特定的愈伤组织释放出的原生质体，而且这些技术并不是对从各种愈伤组织或组织释放的各种原生质体都适用的。换言之，这些技术并不是对大多数种类的原生质体都有重复性。
另一方面，许多研究人员已报告说完全植物已从稻子的培养细胞再生来(Nishi等，Nature 219PP.508-509(1968))。然而这些技术并不使用原生质体。此外，已经发现从在这些技术中所使用的具有高度分化能力的细胞得到一种原生质体是困难的，而且培养这种原生质体也是困难的。
这样，就需要建立一种从原生质体衍生一种愈伤组织或细胞簇的培养原生质体的方法，这种方法对于来源于一种植物的一般的或非特异的细胞的原生质体是有重复性的和可应用的。
因此，本发明的目的是根供一种由原生质体衍生出细胞簇或愈伤组织的培养原生质体的方法，这种方法对于那些从一种植物的普通的或非特异细胞产生的原生质体是有重复性的和可应用的。
在本发明的方法中，原生质体是在一层100到400微米厚的液体介质中培养的。用本方法，原生质体是在稍微有氧条件下培养的。本发明人已经发现这种有氧条件促进了原生质体的生长。
根据本发明的方法，不仅是双子叶植物的原生质体，甚至单子叶植物的原生质体也能很好地生长而形成愈伤组织或细胞簇。
如上所述，按照本发明的方法，原生质体是在大约100至400微米厚的一层液体介质中培养的，200至300微米更好些。按照本发明的方法，原生质体是在稍微需氧的条件下培养的，这种需氧条件被认为是促进原生质体的生长。如果液体介质的厚度大于400微米，对原生质体所供的氧就变得不充足了。如果小于约100微米，原生质体将受到液体-空气界面的不利影响。
由于液体的表面张力，要形成这样一种液体介质的薄层可能是困难的。也就是说如果将小量液体介质放在一个塑料陪替氏培养皿或类似物中，由于它们表面张力介质就变成球状水珠。本发明人把液体介质放在亲水支持体上，从而减少了液体介质的表面张力而完成了制作这样一种液体介质的薄层。较好的亲水支持体包括琼脂、藻酸及其盐类以及明胶。这样把液体介质放在底部表面涂有亲水支持体的陪替氏培养皿中就能形成液体介质的薄层。由于亲水支持体象原生质体一样吸收培养介质，最好是亲水支持体的厚度能尽可能的薄。这样，亲水支持体令人满意的厚度不大于1毫米，最好不大于200微米。另一可取的是亲水支持体含有象蔗糖、甘露醇及葡萄糖这样的渗压剂。此外，亲水支持体可以含有植物激素、维生素和其它营养品，这些可象下面介绍的那样加到液体介质中去。
任何一种常规用于培养原生质体的介质都可以在本发明的方法中使用。例如，如果培养的原生质体为稻的原生质体(属于稻属的植物，象Oryza sativa，Oryza glaberrima和Oryza peren-nis等等)，MS介质(Murashige和Skoog，Physiol.Plant 15 PP.473-479(1962))、B5介质(Gaborg等，Exp.Cell Res.50.PP.151-158(1968))、N6介质(Chu等，Scientia Scinica 18 PP.659-663(1975))及R2介质(Ohira等，Plant Cell Physiol.14，PP.1113-1121(1973))都可用作培养介质。同样，如果所培养的是矮牵牛属植物的一种原生质NT介质(Nagata和Takebe，Planta 99，PP.12-20(1971))可以使用。介质可以含有象2，4-二氯代苯氧乙酸(以下称2，4-D)、苄基腺嘌呤、激动素、玉米素、赤霉素及脱落酸这样的植物激素，菸酸、硫胺素及维生素B6这样的维生素，蔗糖和甘露醇这样的糖类和糖醇类以及其它营养品，这些都是常规地加到为培养原生质体的培养介质中的。这些添加剂的浓度可以根据要培养的原生质体的性质和添加剂的性质而适当选择，例如可为0.1到10毫克/升。本发明人还发现如果介质中含有一种使用过的介质，细胞或原生质体预先在这种介质中培养过，则可进一步促进原生质体的生长。此外，最好把介质的pH调到不大于5.2，更为理想的是3.5-5.2。
培养条件本身可以是常规的，这样，培养条件可以根据要培养的原生质体的性质作适当选择。例如，如果要培养的原生质体是稻的原生质体，培养温度可以是20到30℃，最好是大约26℃，液体介质中原生质体的细胞浓度可以是104到107/毫升，最好是105到5×106/毫升。
本发明的方法可用来培养以任何方法所制备的原生质体。已知有许多释放各种植物的原生质体的方法。如果要培养的原生质体是稻的一种原生质体，例如，原生质体可以得自以酶溶液处理的稻的愈伤组织，这种酶溶液含有0.1到10%(重量)的纤维素酶(最好是1到5%);0.1到5%(重量)的浸解酶(最好是0.5到2%)，0到5%(重量)的氯化钙(最好是0.1到1%)，0到5%(重量)的葡聚糖硫酸酯的钾盐(最好是0.1到1%)。
本发明在参考以下实例时将更容易理解。应予注意的是，提出以下实例的目的仅在于说明，发明的范围决不受其限制。
实例1-稻的原生质体的培养原生质体的制备将稻种(稻栽培品种，品种Nihonbare)在70%的乙醇溶液中浸泡一分钟，再于次氯酸钠水溶液(氯含量为5%重量比)中浸泡15分钟。然后将种子用消毒过的蒸馏水洗三遍，播种在含有0.3%(重量)的酪蛋白水解物、2ppm的2，4-D和1ppm的苄基腺嘌呤的N6琼脂介质上。在26℃下培养三周后，从种子的盾片生成愈伤组织，这些愈伤组织在同样条件下每四周再进行一次传代培养。
将这样得到的愈伤组织悬浮在含有0.3%(重量)的酪蛋白水解物和1ppm的2，4-D的R2液体介质中。细胞于每周进行一次传代培养。传代培养后5至7天所得到的细胞簇在下一步中用于制备原生质体。
这样得到的细胞簇用含有4.0%(重量)的纤维素酶OnozukaRS(可由Yakult药品公司购得)、1.0%(重量)的浸解酶R-10(可由Yakult药品公司购得)、0.5%(重量)的氯化钙、0.5%(重量)的葡聚糖硫酸酯钾盐及作为渗压剂的0.4摩尔的甘露醇的溶液处理。然后将细胞于27℃下在此溶液中轻轻振荡6小时以得到原生质体，再将含原生质体的酶溶液过滤以除去未消化的细胞簇，将滤液以50g离心5分钟以沉淀原生质体。沉淀的原生质体以0.4摩尔葡萄糖的水溶液洗三遍并在下一步中培养。
以亲水支持体涂布容器的底表面将直径为35毫米的塑料陪氏培养皿用作培养介质的容器。每一陪氏培养皿的底表面用大约100微升含有作为基本介质的R2介质、R5介质中的维生素和0.4摩尔蔗糖的0.8%琼脂(Difco公司制造)涂布，以形成一约100微米厚的琼脂层。
培养稻的原生质体的培养介质的配方由稻(稻栽培品种，品种Sasanishiki)的种子的未成熟的胚胎中衍生出来的愈伤组织放在含有0.3%重量比的酪蛋白水解物和1ppm的2.4-D的R2液体介质中培养。将10毫升培养液加至20毫升同样成分的新鲜介质中再继续进行一周一次的传代培养。将传代培养后4至7天的传代培养物过滤以除去细胞。将50微升100ppm的2.4-D、1.37克蔗糖及痕量维生素加至10毫升这样得到的滤液中，以0.1NHCl把滤液的PH调至4.5。将介质再以膜过滤器过滤以进行消毒，在下一步中用作培养原生质体的介质。
向每一个如上所述的底表面以琼脂涂布的陪氏培养皿中，加入40至400微升如上所述得到的，含有106原生质体/毫升的介质，并均匀地铺开，从而形成一层50至500微米厚的液体介质层。将陪氏培养皿密封后，在26℃的暗处培养30天。细胞簇的形成用一倒置显微镜观察。结果见表1。
-无细胞簇形成+形成了一些细胞簇++形成了数百个细胞簇如表1所示，当液体介质的厚度为100至400微米时，观察到了细胞簇的形成，使用200至300微米厚的液体介质时会得到特别好的结果。
实例2-胡萝卜的原生质体的培养由含0.1ppm2.4-D的液体介质中培养的胡萝卜下胚轴衍生出的愈伤组织，用含有2%(重量)的纤维素酶Onozuka R-10、1%(重量)的浸解酶R-10、2%(重量)的Driselase(可由Kyowa Hakko公司购得)、0.5%(重量)的氯化钙及0.7摩尔的甘露醇的溶液来处理。将此混合物于26℃下轻摇3小时以释放原生质体后再以300筛孔的尼龙筛过滤以除去未消化的细胞簇。滤液在100×g离心5分钟以沉淀原生质体。沉淀下的原生质体以0.5摩尔甘露醇洗三次。
将这样得到的原生质体悬浮于含有1ppm2.4-D和0.5摩尔甘露醇的液体介质中，细胞浓度为105/ml。按实例1的作法将含有MS介质的组分和0.5摩尔甘露醇的0.8%的琼脂涂布在35毫米直径的塑料陪氏培养皿内。将300微升上面得到的悬浮液加至此陪氏培养皿内并均匀地铺开。于26℃的暗处进行培养20天。计算生成的细胞簇数，作为对照，将前面的悬浮液加至同样的陪氏培养皿中，但不用琼脂涂布培养皿，原生质体也以同样方式培养。在此情况下悬浮液由于它的表面张力不均匀地铺开而变成小珠。计算生成的细胞簇。结果见表2。
+形成了数十个细胞簇++形成了数百个细胞簇如表2所示，由于将细胞悬浮液均匀地铺在琼脂涂层上，这样所生成的细胞簇比把细胞悬浮液加到未涂层的陪氏培养皿中要多得多，悬浮液在未涂层的陪氏培养皿中变成了小珠。
实例3-矮牵牛属植物原生质体的培养将在温室中生长的矮牵牛属植物的成熟叶子在70%乙醇溶液中浸泡10秒钟，然后在0.5%次氯酸钠水溶液(含氯量为0.5%重量)中浸10分钟以进行消毒。将叶子以无菌蒸馏水洗三次后，把叶子切成1毫米宽的碎片。取0.5克这样得到的切碎的叶片加至一含有1%(重量)的纤维素酶Onozuka R-10、0.3%(重量)的浸解酶R-10和0.4摩尔的甘露醇的溶液中，将此混合物于26℃下轻轻振荡5小时以释放原生质体。再将混合物以250筛孔的尼龙筛过滤以除去未消化的细胞簇。滤液在100×g离心5分钟以沉淀原生质体。沉淀下的原生质体以0.4摩尔的甘露醇洗三遍。
将这样得到的原生质体悬浮在含有1ppm的2.4-D、0.4ppm的苄基腺嘌呤、50毫摩尔糖和0.3摩尔的甘露醇的NT介质中，细胞浓度为105/毫升。将一直径为35毫米的塑料陪氏培养皿按实例1中的方式用含NT介质组分的0.8%琼脂涂层。将300微升上面的悬浮液加至此陪氏培养皿中并均匀铺开。在26℃的暗处进行培养20天，数出所生成的细胞簇数。作为对照，将上面所说的悬浮液加至相同的陪氏培养皿中但不用琼脂涂层，原生质体按同样方式培养。在这种情况下，悬浮液不是均匀地铺开而是由于它的表面张力而变成小珠。数出所生成的细胞簇数。结果示于表3。
+生成了数十个细胞簇++生成了数百个细胞簇如表3所示，由于将细胞悬浮液均匀地铺在琼脂涂层上，比把细胞悬浮液加至未涂层的陪氏培养皿中生成的细胞簇要多得多，悬浮液在未涂层的陪氏培养皿中变成了小珠。
权利要求
1.一种培养原生质体的方法特征在于包括在大约100至400微米厚的液体介质层中培养原生质体。
2.按权利要求
1的方法，其中液体介质层的厚度约为200至300微米。
3.按权利要求
1的方法，其中液体介质层放在一种亲水支持体上。
4.按权利要求
3的方法，其中亲水支持体是由琼脂、藻酸及其盐类以及明胶中选出的一种。
5.按权利要求
4的方法，其中亲水支持体的厚度不超过1毫米。
6.按权利要求
5的方法，其中亲水支持体的厚度不超过200微米。
7.按权利要求
1的方法，其中原生质体是稻、胡萝卜或牵牛属植物的原生质体。
8.按权利要求
7的方法，其中原生质体是稻的一种原生质体。
9.按权利要求
8的方法，其中稻是Oryza sativa。
10.按权利要求
8的方法，其中介质包括它的基本介质R2、N6、Ms或B5介质。
11.按权利要求
9的方法，其中介质还包括0.1到10毫克/升的2，4-D。
专利摘要
本文叙述是一种在一液体介质中培养原生质的方法。按照本发明的方法，原生质体是在厚约100至400微米的液体介质层中培养的。
文档编号C12N5/10GK86103374SQ86103374
公开日1986年11月26日 申请日期1986年5月21日
发明者藤村达人, 樱井基 申请人:三井东化学株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan