专利名称:一种制备二肽和胺的加成化合物的方法
已知蛋白酶不但可催化肽键的水解裂解，而且还可催化氨基酸衍生物肽键的结合而形成二肽。德国公开专利2，801，238(美国专利4，165，311、4，256，836和4，436，925号)描述了加成物的制备方法，该化合物一方面是由-N保护的单氨羧酸酯而另一方面说是由二肽组成，亦即由该单氨羧酸酯及单氨双羧酸在一酶促酯化反应中制备。加成化合物不溶于反应介质并被提出。但该反应的实际目的不是合成加成化合物而是未保护的二肽本身。几种文献中所描绘的方法，其中包括上述德国公开专利，涉及到分解加成化合物而得到二肽。
出人意外的是，目前已经发现了在反应介质中存在胺的情况下，酶促N保护天冬氨酸与苯丙氨酸甲酯的反应中产生的二肽形成了少量可溶性盐。这个反应的产生比按上述德国公开专利所描述的具有L-、D-或D，L-苯丙氨酸甲酯的加成产物的形成还快。
因此，本发明涉及1.一种新型的具有通式Ⅰ胺的二肽加成化合物，
其中R是氨基保护基，Y是没有α羧基或其衍生物的胺。
2.一种制备上述通式Ⅰ化合物的方法，其中R是氨基保护基，Y是氨基化合物，通过通式Ⅱ化合物
与L-苯丙氨酸甲酯在水介质中，以存在蛋白酶及适宜酶活的PH范围为条件的反应，它含有被用作Y的没有α羧基及其衍生物的胺。
本发明在下文中将进行更详尽的描述并于权利要求
书中加以限定。
化学反应由下式表示
很明显，在这个反应中，应用一氨基保护基团保护天冬氨酸的氨基。最好是氨基甲酸乙酯类的基团，特别是苄酯基或叔丁氧羰基。
天冬氨酸衍生物能够作为有机碱使用，在其存在的情况下，与L-、D-和(或)D，L-苯丙氨酸甲酯，通式为H3-nNR′n的胺类酶促下反应，H3-nNR′n中的a)n是1、2或3以及b)R′为相同的或不同的烷、环烷、芳烷或芳香基团，最好具有至多18个碳原子，它们中的至少一个具有至少6个碳原子，它可能表现为2或3个R′基形成一个环，并在适宜的地方包含氮原子，以及c)它的可溶于水的羧酸或无机酸盐。
最适用的化合物是那些R′为相同的或不同的具有6～8个碳原子的烷、环烷或芳烷基的化合物，或者那些2～3个R′基与氮原子一起形成一个具有多至10个碳原子的饱和或不饱和的环状化合物。例如将在下文中提到的苯甲胺、二苯甲胺、双(氨甲基)苯类，象3-氨基甲苄胺、对氨基苯-2′-乙胺、喹啉和二环化己胺。此外，也可用通式为NR′4X的季氨盐代替胺，其中X是酸根。
反应也可在缓冲或不缓冲的水性介质中进行。缓冲液的PH范围对应于酶的活性范围。0.05～1mol浓度的缓冲液最好，尤其是0.1～0.5mol。天冬氨酸衍生物和苯丙氨酸甲酯相对于反应介质的重量浓度为1～25%。组分的摩尔比在20∶1～1∶50之间，但最好是5∶1～1∶5之间。过量的苯丙氨酸酯，例如当使用外消旋起始物时用D-酯类，令人惊奇地并没有干扰，因为正如已经发现了的那样，与胺的加成反应比和过量的苯丙氨酸酯的反应快得多。
本发明中所用的胺能够以与二肽等摩尔量加入。一般说来，较好的结果取决于过量的程度，特别是1～50倍，最好是2～5倍摩尔过量。胺可以游离化合物或盐，尤其是盐酸盐或硫酸氢盐的形式应用。
催化该反应的酶是蛋白酶或含金属蛋白酶，例如α-胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶，它们可单独或混合使用。该反应所用酶量在每毫摩尔起始化合物5U-30，000U范围内，最好是50U～10000U。反应温度为4～50℃，最好是35～40℃，并取所用酶的最适PH，一般为PH5～7。保温时间2～80小时，最好是20～30小时。
本发明的加成化合物随后用已知方法降解，从而获得游离二肽。据此便可极便利地得到L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。
本发明方法使得加成化合物的形成比在前述德国公开专利中所描述的过程产生得更快。而且，将用过的胺作为加成化合物裂解中的无机酸盐提出，并与强碱一起从此溶液中游离出来，即可容易地回收加成化合物。可是，已知的方法有缺陷，游离苯丙氨酸酯在操作过程中将被水解。
下述实例将本发明进行进一步的详细叙述。百分比为重量百分比。
实例11.79g(8.31mmol)苯丙氨酸甲酯盐酸盐与2.22克(8.31mmol)L-N-苄氧羰基-天冬氨酸加入0.5ml7%氨水溶解于20ml重蒸水及4mlPH6的1mol磷酸钠缓冲液。随后，17ml14，7%的二苯胺硫酸氢酯水溶液加于混合液中，用7%氨水调PH为6。加入1325μ的嗜热菌蛋白酶后在40℃下保温24小时，然后提取出加成化合物沉淀。1μ的嗜热菌蛋白酶在40℃PH7.5下每分钟水解1mmolZ-甘氨酰苯丙酰胺。加成产物在从乙酸乙酯，甲醇，己烷的8∶1∶1(V∶V∶V)混合液中重结晶后的产率为62.5%。
下列分析结果为进一步特征熔点135～137℃元素分析C36H39N3O7(625.72)，C69.3，H6.1，N6.8;
1H-NMR(CDCl3，100MHz)δ＝7.59-7.11(数个重叠m，24H);
5.03(S，2H，C6H5-CH2-O-CO-NH-);
4.60-4.30(两个重叠m，2H，-CH2-CH＝)，3.75(S，4H，C6H5-CH2-NH)，3.61(S，3H，-CO2-CH3)，3.49-3.31(两个重叠m，4H，-CH2-CH＝)ppm旋光度〔α〕25D°＝4.91°(C＝1，甲醇)实例2按实例1的方法进行，但PH为7。加成物产率为71%。
实施3
按实例1的方法进行，PH5，加酶后40℃下保温70小时。产率为57%。
实例4按实例1的方法进行，但加入70%17.8ml二苯胺硫酸氢酯(42.25mmol)，4℃保温70小时，产率59%。
实例5按实例1的方法进行，氨基酸衍生物悬浮于16ml重蒸水和8ml 1mol磷酸缓冲液中，加入胺和酶后混合物于50℃下保温9小时。产率81%。
实例6按1法进行，但不同的是用等量重蒸水替换所述缓冲液并加入265μ嗜热菌蛋白酶。产率为58%。
实例7按1法进行，加入5300μ嗜热菌蛋白酶，反应混合液40℃下保温4小时。产率为83%。
实例8开始按1法进行，但加入17ml11.5%3-氨基-甲苄胺硫酸单氢酯(0.083mmol)的水溶液取代二苯胺硫酸氢酯。随后按实例7法进行。从乙酸乙酯、甲醇和戊烷8∶4∶2(V∶V∶V)混合物中重结晶后加成物产率为21.7%。
下列分析结果为进一步特征熔点116～119℃元素分析C30H36N4O7(564.639)C63.8，H6.4，N9.9.
1H-NMR(d6-DMSO)δ＝7.60-7.09(数个m，21H，-CO2H，2NH，2NH2)5.00(S，2H，CH2-OCO-NH-);
4.5-4.23(2m，2H，-CH2-CH＝)，
4.00(S，4H，H2N-CH2-C6H5)3.61(S，3H，-CO2CH3)3.45-3.17(二重叠m，4H，-CH2-CH＝)ppm旋光度〔α〕25D°＝5.82°(C＝1，甲醇).
实例9按1法进行，但加入17ml8.6%2-(4-氨基苯)乙胺盐酸盐(8.3mmol)水溶液取代二苯胺硫酸氢酯。从乙酸乙酯中重结晶出来后产率为84%，熔点为122～125℃。
实例10按1法进行，0.179g D、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(0.83mmol)取代1.79g L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐，并以二苯胺硫酸氢酯29.4%水溶液的形式加入双倍量的胺(16.9mmol)。产率为69%。
实例11.
按1法进行，用11.2%喹啉硫酸氢酯水溶液(8.42mmol)取代二苯胺硫酸氢酯。重结晶后产率67%，熔点127～134℃。
实例12在实例1的基础上进行。1.63g(8.35mmol)N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸和1.80g(8.35mmol)L-苯丙氨酸甲酯溶解，加入17ml17.6%二苯胺硫酸氢酯(10.1mmol)水溶液。反应混合物在PH7，35℃下保温40小时。从乙酸乙酯，甲醇和己烷10∶2∶5(V∶V∶V)混合液中重结晶后产率为56%，熔点107～112℃。
权利要求
1.一种用于制备Ⅰ式化合物的方法
其中R是氨基保护基团，Y是胺类，通过R是氨基保护基团的Ⅱ式化合物
与L-苯丙氨酸甲酯在蛋白酶存在的水介质中并以蛋白酶活性的PH下反应形成，它包含有用作Y的胺，Y不含有α羟基或其衍生物。
2.按权项1所述方法，其中R为氨基甲酸酯类的保护基。
3.按权项1或2所述方法，其中R为苄氧羰基或叔丁氧羰基。
4.按权项1～3的一个或一个以上所述方法，其中用作Y的胺具有通式H3-nNR′n结构，其中a)n是1、2或3，且b)R′为相同或不同的烷、环烷、芳烷或芳香基，其中至少一个具有至少6个碳原子，可能2～3个R′基形成环状，在适宜时含有氮原子，以及c)它的可溶于水的无机酸盐或羧酸盐。
5.按权项1～4的任意一个所述的方法，其中R′为相同的或不同的烷、环烷或芳烷基团，它们有6～8个碳原子，或2～3个R′基与氮原子一起形成一最多具有10个碳原子的饱和环。
6.按权项1～5中任意一个所述的方法，其中加入过量的胺。
专利摘要
由N保护L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸甲酯合成的二肽与胺类形成微溶性加成化合物，该化合物可易于从反应介质中提出。
文档编号C07K5/00GK86103254SQ86103254
公开日1986年11月26日 申请日期1986年5月13日
发明者马丁·普拉坦, 雷霍德·凯勒, 默坦·施林曼 申请人:赫彻斯特股份公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan