专利名称:卤芳香基腈降解基因，其用途以及含该基因的细胞的制作方法
本申请为1986年1月8日提出的编号为817，226的申请的部分继续申请，该申请揭示的内容在此被采用作参考。
向微生物及高等有机体的细胞提供新颖的遗传特性的机会，为获得新的遗传特性开辟了一条广阔的途径。
讨论的一个方面是涉及到因其细胞毒作用而被采用的许多制剂，例如，农业上所用许多化合物直接用于杀灭害虫、杂草等。在很多情况下，这些化合物具有较长的滞留时间或者持久地残留。
在许多情况下，人们希望将那些欲杀死的物种与欲保留的物种区分开来。例如，人们常常想要有选择地杀死杂草而同时又对庄稼产生最少的不利影响。大部分情况下，许多除草剂都对庄稼产生相当大的不利影响，因而这些除草剂的应用基本上仅限于备急情况下使用或者次紧急情况下谨慎地使用。
因而要是能够对活细胞加以改进使之产生对细胞毒制剂之类的威胁的抗性就具有很大的意义。
美国专利4，535，060号描述了将草甘膦(glyphosate)抗性赋于对草甘膦敏感细胞的细菌aro A基因的应用。Hsu和Camper在Can.J.Microbiol.(1976)22卷537至543页上描述了从富含土壤的培养物分离到苯甲腈(ioxynil)降解物。Hsu和Clemson在Dissert.Abstr.Intrn.B36(1976)第8，3708，号上描述了3，5-二卤-4-羟基苯基氰一类除草剂的微生物降解作用。Ingram和Pullin在Pesticsci.(1974)第5册287至291页上描述了溴苯腈(bronoxynil)在三种类型土壤中持久性。Smith在Abstrp.MeetingWeed Soc.Am.(1971)的第16至17页上描述了溴苯腈在勒吉那(Regina)重粘土中的降解作用。
Smith和Fletcher在Hort.Res.(1964)上的4册第60至62页上对3，5-二囟-4-羟苯基氰和土壤微生物进行了报导。
本发明提供包含腈水解酶、为这些腈水解酶编码的核酸顺序，含有在一种所需要的宿主(腈水解酶基因对它来说是外来物)所识别的调节基因的转录的和转译的调节控制下为这类腈水解酶编码的基因的构成物、含有这类构成物的宿主细胞以及含有这些构成物的有机体、有机体部分或产物。已经发现溴苯腈和/或碘苯腈(ioxynil)特异的腈水解酶可用于含有溴苯腈及有关的除草剂的产地的去毒性之用，同时可保护宿主细胞免受这些除草剂的细胞毒作用。这些构成物发现可用于区分那些含有这种构成体的宿主细胞与缺乏这种构成物的宿主细胞。
根据本发明，可以提供与囟代羟基苯并腈，特别是3，5-二溴-或3，5-二碘-4-羟基苄腈的水解有关的新颖的DNA顺序、构成物及转化了的细胞、植物以及肽。本发明涉及到能够水解腈的一种酶的生产，以便去除具有杀草活性的腈的毒力，并向对除草剂敏感的细胞，或宿主提供保护作用或者对含有该除草剂的环境进行解毒。
这种有意义的结构基因可以从显示出能够将苯基氰作为氮源，通常将苯基氰作为唯一氮源的单细胞微生物中获得，特别是从细菌中获得。关于苄腈或腈水解酶，意思是指苄腈是一种卤代P-羟基苄腈，特别是3，5-二碘或3，5-二溴-4-羟基苄腈，腈水解酶是一种能将卤代苄腈作为氮源，特别是作为其唯一的氮源的水解酶。
这种酶可以通过不同的途径获得，可以方便地从天然存在于含有溴苯腈的或磺苯腈的环境中的细菌获得。特别是肠道细菌，再进一步讲是克氏杆菌(klebsiella)种，是可获得这种酶的。肺炎克氏杆菌(klebsiella pneumoniae)，特别是变异体(klebsiella ozaenae)是可以采用的。这些细菌可以在土壤或其它苄腈的浓度越来越高的培养基中生长，而不是从土壤中分离，减少其它的可供选择的氮源直至获得可用苄腈作为唯一的氮源而生存的细菌为止。
不管含有腈酶的细菌的来源如何，进行的筛选必须确保腈水解酶对苄腈的去毒作用效力。此外，这种腈水解酶应对苄腈具有特异性而不对缺少卤素的具有其他取代基的其他类似物具有特异性。因此，本发明的腈水解酶将是正如定义的那样是对苄腈具有特异性，对于类似物相对地是没有活性的或者活性低得多。与在可比较的浓度下以苄腈作氮源比较，在正常氮源如氨存在下，细菌的增殖率最理想的是不应显著减少，就是不少于大约10%。这一结果对于非特异性的苄腈酶是得不到的。
一旦鉴定了一种以上宿主品系，那么这些技术便可用于鉴定这种腈水解酶的编码顺序。该基因可能存在于染色体或者质粒中。基因组可以被打碎，特别是用限制性内切酶将之切碎，对于基因组采用一种或者多种核酸内切酶进行内切可以提供大小从5Kb至50kb范围的片段。这些片段可以被克隆至合适的细菌(例如大肠杆菌)中的合适的载体上。对产生的转化体进行筛选以选择腈水解酶的活性，其中宿主有机体提供的环境是不利的。一旦一种或多种克隆被确认具有腈水解酶的活性，那么含有所需求的DNA片段的染色体外组成物、质粒或者病毒可以通过通常的技术，诸如宿主的溶胞作用、DNA沉降作用，以及通过将载体DNA或质粒或者病毒DNA从染色体DNA上分开的方法来进行分离。然后，染色体外组成物可以用限制性核酸内切酶来切开，用各种分离及鉴定各种不同大小片段的技术，例如，电泳、密度梯度离心法等来分离所需要的片段。
根据片段的大小，通常还经进行进一步的处理以使片段大小减小到以使其更接近于该基因及其侧翼的调节区域的大小。目前已有多种技术用于处理含有为那种酶的编码顺序及其调节侧翼顺序的片段。可以采用在不同的反应混和物中用不同的限制性酶进行部分切开，然后，对这些片段进行克隆以确定哪些片段仍然保留了表达腈水解酶的能力。
另一方面，该酶可以进行分离并进行部分顺序分析。根据氨基酸的顺序，可以制备用于确定具有该基因的片段的探针。通过将这种方法与限制性酶切相结合，可以对片段进行克隆和筛选以了解是否具有所需要的基因。此外，也可以用核酸外切酶，例如Bal31将片段的一端或者两端的核苷酸切除以进一步减少多余的核苷酸数目。
另一方面，通过用探针筛选及通过在合适的体内或体外转译系统，如xenopus卵母细胞(Xenopus oocytes)或(reticulolysate)或者诸如此类的转译系统中进行鉴定，而该基因在合适的宿主中被克隆并使信使RNA得到分离。利用包括逆转录酶及采用DNA聚合酶形成互补链的常用技术，将分离了的信使RNA用于制备cDNA。在这例子中，所得到的结构基因缺少与转录相关的调节区域。
包含这种表达腈水解酶的结构基因的DNA顺序可以被接合入很大一类其它DNA顺序中以导入合适的宿主细胞之中。互伴的顺序(companion seguence将取决于宿主的性质及该DNA顺序导入宿主的方式以及人们所期望是游离基因(episomal)处于维持的状态还是处于整合的状态。
对于原核生物宿主而言，存在着很大一类载体可以通过转化作用或者接合作用、转导作用或转染作用而将DNA顺序导入原核生物宿主中。DNA顺序包括很大一类的质粒如，pBR332。pACYC184。pMB9、pRK290等等;及柯斯粒(cosmid)如，pVK100;或者病毒如;p22等等。
对于真核生物宿主而言，有很多的技术可用于将DNA导入宿主，如用Ca++沉淀的DNA，包括一个非复制DNA顺序或一个质粒或小染色体，进行转化或者用一个包含农业细菌(Agrobacterium)的顺序的T-DNA进行的转化以及利用微量吸移管或electroporation)进行微注射。在该DNA结构中究竟是否存在一个有效的复制系统，决定了DNA是被作为游离基因组成物(episomal element)被复制，还是DNA是被整合到宿主的基因组，决定结构基因在宿主中的表达。游离基因组成物可以被采用，诸如肿瘤引起的质粒，例Ti或Ri，或片段;或病毒，例如CaMV，TMV或其片段，这些游离基因组成物对宿主是非致死的，并且结构基因是以允许被表达的方式存在于这类游离基因组成物之中的。特别有意义的是这些片段具有复制的功能而缺少其它功能，如肿形成及毒性等等。
从腈水解酶源所获得的片段可以采用一个合适的克隆载体而进行克隆。克隆可以在一个合适的单细胞微生物，例如大肠杆菌之类的细菌中进行。最理想的是采用一种柯斯粒(cosmid)，在那里，部分或完全消化可提供具有所需要大小的片段。例如，柯斯质粒(cosimd)p VK100可以用一种合适的限制酶进行部分消化，并连接到通过部分或完全消化质粒或染色体或其片段而获得的片段上。装配必须确保仅使所需要的大小的片段被装配并转导入宿主有机体内。
宿主有机体要选择对苄腈具有抗性的。对受体菌株可以进行改良以提供合适的遗传特性，而这种遗传特性允许对转导体进行选择。在微生物中，转导体可以使之与其它的微生物接合，当需要的时候可采用迁移质粒。多种技术可以用于进一步减少含有腈水解酶的结构基因的片段的大小。例如，对柯斯质粒(cosmid)载体可以进行分离并用许多限制性核酸内切酶例如EcoRⅠ、BglⅡ和SmaⅠ等进行切断，然后将得到的片段在合适的载体克隆，可方便地利用先前使用过的柯斯质粒(cosmid)载体。许多克隆载体例如pACYC177及pACYC184比较小，可用于代替柯斯质粒(cosmid)载体。因而，最好是小于5kb，通常小于4kb，最佳为小于2kb左右的片段可以进行克隆并提供对苄腈的抗性。
最理想的片段是大约1kb左右，并小于5Kb左右，最好小于大约4kb，特别是至少为1047bp，尤其是以含有至少有1100bp左右侧翼区，最好小于1.5kp的为佳。
最好的是从克氏杆菌(klebsiella ozaenae)中得到的BglⅡ-SmaⅠ片段，尤其是大约1210bp的PstⅠ-HincⅡ片段更好。
腈水解酶可以通过原核生物或真核生物包括细菌、酵母、丝状真菌或植物细胞等等的任何一种方便的来源进行表达。在这里没有发现决窍，酶是根据已知的方式通过将细胞溶破进行分离的。可用的方式包括色谱法、电泳、亲合色谱法及其诸如此类的方法。溴苯腈可以方便地通过合适的功能团，例如羧基结合到不溶的载体上，用于腈水解酶分离的填充物的支持物上。
正如Harper在Biochem.J.(1977)167卷685～692页上所描述的条件下，腈水解的特异性活性至少为大约0.1微摩尔氨/分·毫克蛋白，一般不低于大约0.5微摩尔氨/分·毫克蛋白或者更高一些。
提纯了的酶可以各种方法被应用。它可以直接用于测定溴苯腈、碘苯腈或其他的相关的苄腈。
该酶还可以通过与被分析物(如半抗原或抗原)或抗体相结，可用于诊断分析，那些诊断分析是由美国专利第3，654，090及3，817，837及3，850，752号加以描述。这些专利中已极为详尽地描述了结合的方法和被分析物浓度的确定，这些专利所揭示的适当部分已合并作为参考为腈水解酶编码的DNA顺序可以以各种方法被应用。这种DNA顺序可以用作分离野生型的或者变异型的腈水解酶的探针。另一方面，该DNA顺序可以通过将之重组入宿主而进行整合，以向宿主提供苄腈的抗性。
对植物细胞来说，作为构造体的结构基因可以通过微量吸移管注射作用导入植物细胞通过重组整位进入宿主的基因组。此外，结构基因因转导而引入植物宿主中的过程可采用electroporation。在从具有不为植物宿主所识别的调节信号的来源获得结构基因时，需要引入合适的基因用于表达在采用病毒或者质粒，如肿瘤诱导的质粒，并已作过基因图分析的地方，可以选择位于启动下游的一个限制部位结构基因可在与启动子的合适距离插入该限制部位。在DNA顺序不提供合适的限制部位时，可以采用核酸外切酶诸如Bal31进行多次的消化，并插入一个合成的限制性核酸内切酶位点(联结子)。特别有趣的是肿瘤诱导质粒如Ti或Ri的采用，在这里腈水解酶基因可以整合进入植物细胞的染色体之内。对于Ti质粒及Ri质粒的采用的描述可见于PCT公告第WO84/02913、02919、02920和EPO申请第0116718号和Matzke及Chilton所著的J.Mol App.Genetics(1981)的第一册的39～49页。
通过采用TDNA右边缘或两个边缘，在这里，两个边缘位于在包括在被植物宿主所识别的起始和终止的转录和转译的调节信号下腈水解酶结构基因的表达盒expression cassette)的侧面，表达盒可以被整合进入植物基因组以提供在植物分化的各个不同的阶段，能在植物细胞中表达。
可以制备各种构成物以提供在植物细胞进行表达。这些构成物提供一种在植物中可起作用的表达盒用于在植物宿主中表达腈水解酶。
为了提供转录，可以采用多种转录起始区(启动子区域)、构成区或诱导区。
转录起始区域被结合到为腈水解酶的编码结构基因以提供从起始密码子的上游转录起始，一般在起始密码子中占200个碱基，在这里，不转录的5′区缺乏ATG。
结构基因的3′-末端有一个或多个终止密码子，这些终子密码子将加入植物宿主中起作用的转录中止区域，该终止区域与作为起始区域的相同的或不同的结构基因联结作为起始区域。
如果表达盒合适的话，其特征应该为在转录的方向上具有起始区域及由起始区的转录控制下的结构基因和使转录终止并对信使RNA进行加工的终止区域。对于转录及转录调节区域奥派启动子(Opine promoter)和终止区可以被采用，这就允许腈水解酶基因的组成表达(Constitutive expression)。其他的启动子和/或终止区也可应用，特别是在植物宿主中提供诱导表达或调节表达的启动子。可以采用来自于Ti-质粒的启动子区包括奥派启动子如，章鱼碱合酶启动子及篮曙红合酶启动子及agropine合酶启动子及manopine合酶启动子等。其它的启动子包括病毒启动子如CaMV第四区启动子或者全长(35S)启动子，这些启动子是与核酮糖-1，5-二磷酸羧酸盐碱基，例如小的亚单位相关联、这些基因是与云扁豆蛋白和蛋白储藏、纤维素B-Conglycinin及形成等相关的。
各种顺序可以用通常的方法结合在一起。一启动子区可以通过结构基因的5′区，例如奥派基因(opine)gene和通过限制性基因图分析来确定和顺序分析可以进行选择和分离。同样，终止区可以作为结构基因3′位区而进行分离。该顺序可以在正确取向被克隆和结合以提供腈水解酶基因能在植物宿主中组成表达。
通过将表达腈水解酶的功能基因导入而对作物细胞进行改造的方法，人们可以将其浓度足够彻底地去除杂草的溴苯腈和碘苯腈或类似除草剂用于各种农作物，同时对农作物不产生影响。采用这种方法，可以取得巨大的经济效益，因为肥料和水份可以有效地被利用，可以避免由于存在杂草而引起的不利作用。
表达腈水解酶的表达盒可以导入各种植物;单子叶植物和双子叶植物，包括玉米、小麦、大豆、烟草、棉花、西红柿、土豆、(Brassica)、水稻、花生、矮牵牛(Petunia)、向日葵、糖甜菜或者(turfgrass)等等。这种基因可以存在于细胞或者植物体的某部份，包括愈伤组织、组织、根部、块茎、(Propagules)、(Plantlets)、种子、叶子、籽苗及花粉等等。
通过向植物提供对苄腈的抗性，可以采用各种各样配方以保护作物免于杂草的危害，以此促进作物生长和减少对营养的竟争。例如，溴苯腈可以单独或者与其它产品一起，用于经过保险的作物例如向日葵、大豆、棉花或者玉米等等，以对杂草进行次紧急(Posteme-rgence)控制。
通常施用于田野的杀虫剂配方中的数量大约为0.1～4磅溴苯腈/英亩，最佳数量为0.2～2磅溴苯腈/英亩其中其它的杂草剂的数量大约为0.1～4磅活性成份/英亩。配方中包括其它的添加剂，例如，去垢剂、佐剂、扩散剂、粘着剂、稳定剂等等。配方既可以是湿态的也可以是干态的，如本领域所知的那样，包括有可分散的粉末及可乳化的浓缩物或液体的浓缩物。
除草剂溶液可以按照通常的方法施用，例如通过喷雾、灌溉或撤粉等等。
以下实施例只提供作说明用而非用于限制。
实验限制性酶和用于连接的T连接酶根据制造厂家推荐被采用。
根据纽约的Cold Spring Harbor实验室的Maniatis等人所著的《Molecular Cloning∶A Laboratory Manual》(1982)所介绍的按照克隆标准方法和分子分析法来进行的。克隆分析是按照Ish-Horowitz等人在《Nucl.Acids Res》(1981)第9卷的2989～2998页所述的方法来进行的。
大肠杆菌菌株MM294被用于所有的克隆实验(Hanahan，Mol.Biol(1983)166卷557～80页)在应用时的抗生素水平为Cm(氯霉素)25ug/ml;Tc(四环素)10ug/ml;Ap(青毒素)300ug/ml。
在大肠杆菌中质粒DNAS的转化作用是根据Mandel和Higa所著的《J.Mol.Biol.》(1970)中的第53和159～162页所介绍方法进行的。
对从含有溴苯腈的土壤样品所获得的细菌分离物进行分离和筛选。这种微生物之一被确定为肺炎克氏杆菌(Klebsiella Pneumoniae)的Ozaenae亚种。对于来自上述有机体的溴苯腈特异腈水解酶的部分纯化和表征鉴定得到了一种活性酶其表观分子量为34千道尔顿。
经过在固态L琼脂糖上对克氏杆菌(K.Ozaenae)重复接种获得一种变异体，当这种变异按照Barmett及Ingraham在《J.Appl.Bacteriol.》(1975)第18卷的131～143页上的描述而配制的有每升中含有KH2PO4(1.5g)、K2HPO4(3.5g)、MgSO47H2O(0.1g)、酵母抽提物(50mg)、0.1%的柠檬酸、甘油和琥珀酸、以及微量元素的液体培养基上生长时，它们不再能利用溴苯腈作为唯一的氮源。该培养今后将被称为YETE多碳培养基。该YETE多碳培养基包含0.05%的溴苯腈。尽管该种有机体不能利用溴苯腈作为唯一的氮源，但在含有0.05%溴苯腈L肉汤上可以生长至最大的密度。将克氏杆菌(K.Ozaenae)变异体菌落选出并在10ml L肉汤上生长。将三个独立的克氏杆菌(K.Ozaenae)菌落从含有苯腈的一个LB板上选出，并在相同条件下生长。这样四个相同的菌落同时在用0.05%溴苯腈补充的10ml L肉汤上生长。培养物在30℃下生长至最大密度，并用Ish-Horowitz等在《Nucl.Acids Res》(1981)第9卷2989页上描述的方法从每个培养物上制备mini-prep质粒DNA.未经消化的质粒DNA在0.5%琼脂糖凝胶上电泳，并通过溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓过滤(Straining)而显现质粒带。
克氏杆菌(K.Ozaenae)变异体在溴苯腈存在或不存在下生长，产生单一的质粒种(68Kb大小)。三个克氏杆菌(K.Ozaenae)菌落在0.05%溴苯腈存在下生长时显示一个大的质粒种(90Kb)。三个克氏杆菌(K.Ozaenae)菌落中的二个，在有溴苯腈存在时，有两个质粒形式存在。这数据表明，当溴苯腈选样物解除时大的质粒种转化为小的质粒形式，伴随着大约22Kb的质粒DNA的损失。四个菌落都生长在200ml的含0.05%溴苯腈的L肉汤中。细胞用法兰西压机(French Press)打碎，高速离心的上清液用含有0.05MKPO4PH7.5和2.5mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液渗析，对每个粗提取物进行特异性腈水解酶活性的测定。从克氏杆菌(KOzaenae)变异体制备的粗提取物不含有可检测的腈水解酶的活性，而另三个其他克氏杆菌(K.Ozaenae)粗提取物所显示的腈水解酶的特异活性分别为0.124、0.105和0.143umol NH/mm mg蛋白。在30℃下，细胞(200ml)在含有0.1%葡萄糖和0.04%溴苯腈的Mg培养基(Miller(1972)著的《分子遗传学实验》(GOld Sping Har bor实验室)上生长至mid log时期。粗提取物通过将细胞破碎超离心和在含有0.05M KPO(PH7.5)及2.5mM DTT的缓冲液中对上清液进行透析而制成。在所有的测定中基质的浓度均为3mM溴苯腈。按照Har Per在Biochem.J.(1977)第167卷685～692页描述的方法对NH3的释放进行监测。克氏杆菌(K.Ozaenae)变异体在含有溴苯腈的L肉汤上生长的能力可能引起该有机体对该化合物的不渗透性。然而，该有机体不能在将溴苯腈作为唯一的氮源的精制的培养基中生长。
概括地说，克氏杆菌(K.Ozaenae)腈水解酶好象是由质粒编码的。编码酶的基因好象存在于，在缺少溴苯腈情况下是克氏杆菌(K.Ozaenae)质粒自发丧失的一个22KB质粒DNA上。
克氏杆菌(K.Ozaenae)溴苯腈特异腈水解酶在大肠杆菌中的表达从在0.05%溴苯腈选择作用下生长的克氏杆菌(K.Ozaenae)的质粒DNA被制备后，转移到大肠杆菌菌株MM294(thi gyr A96、end I-、hsd R17)。在添加0.05%溴苯腈作唯一氮源的缺氮(N-)固体琼脂糖最低培养基[每升含KHPO(1.5克)、KH2PO4(3.5克)、Mg SO47H2O(0.1克)和0.1%葡萄糖]上选择出转化实变型。在保温5天后，在选择板上出现了10个菌落。这些菌落在含有0.05%溴苯腈的L琼脂糖板上再划线进行培养，并测试在MM294中是否存在硫胺素营养缺乏标记物。这些菌落没有一个能在缺少硫胺素的最低培养基中生长的，这表明该菌株是大肠杆菌MM294。所有的菌落都可以在添加硫胺素M9培养基上生长并以0.05%溴苯腈为唯一的氮源的。在缺少溴苯腈的这种培养基上没有看到菌落的生长。这些菌落中选择两个以用作进一步的分析。当对含90Kb质粒的大肠杆菌MM294粗提取物制剂的溴苯腈特异性腈水解酶活性进行测定时，可以获得比活性为释放0.216umolNH3/mm mg。含有较小质粒种的大肠杆菌MM294不产生可检测出的腈水解酶活性。大肠杆菌中的较大的90Kb的质粒称为PBrx1，而较小的称为PBrx1△。
为了确证含有的质粒PBrx1，大肠杆菌菌株MM294产生合适的代谢物确定溴苯腈特异性腈水解酶作用的结果，而将2毫升在用MM294(PBrx1)培养物在30℃下，在添加0.05%溴苯腈的M9培养基中生长24小时。培养物滤液样品放在一个C18HPLC柱上进行层析。在培养物滤液中所有加入的溴苯腈被转化成一个新的代谢物峰。用光谱分析对代谢物峰进行测定证实为3′5-二溴-4-羟基苯甲酸(DBHB)。因而，溴苯腈特异质粒编码的腈水解酶在大肠杆菌中表达的产物是与在克氏杆菌(K.Ozaenae)中观察到一样的。
溴苯腈特异腈水解酶基因在大肠杆菌中被克隆。
为了测定DNA片段编码的溴苯腈特异酶是否能够在大肠杆菌中被克隆，质粒p Brx1用BamHⅠ消化分别得到53Kb和37Kb两个带。BamHⅠ片段被连接进入大肠杆菌质粒载体pACYC184(Chang及Cohen所著《J.Bacteriol》(1978)134册1141页)的BamⅠ位点上，转化入大肠杆菌菌株MM294。克隆进入p ACYC184的BamHⅠ位点引起了的四环素抗性基因的插入抑制。选择4个氯霉素抗性、四环素过敏的MM294菌落，制备mini-prep克隆分析DNA，并用BamHⅠ消化该DNA。四个克隆含有37Kb BamHⅠ片段，而有一个克隆含有PBrx1的较大的53Kb BamHⅠDNA片段。五个克隆包含1个同样也在质粒PBrx1△中的克隆的BamHⅠ片段，该片段与PBrx1的自发性地缺失22Kb的质粒DNA后剩下的片段相对应。所有10个克隆在200ml有20μg/ml氯霉素(为该质粒而选择)的L肉汤中生长，获得粗提取物制剂并对提取物的溴苯睛特异的腈水解酶活性进行测定。四个含有37Kb BamHⅠ片段的克隆显示了的腈水解酶特异的活性为0.140μmcleNH释放/分·毫克蛋白的水平，而另六个克隆则检测不出有腈水解酶的活性。该数据表明编码溴苯腈特异腈水解酶活性的基因是位于克隆自质粒PBrx1的37Kb BamHⅠ片段上，并且在不存在溴苯腈选择情况自发地丢失的该22Kb的DNA片段是在37Kb BamHⅠ片段之中的。
就载体PAcyc184而言，为了证实BamHⅠ片段的定向，从上述的四个克隆获得的DNA用EcoRⅠ进行消化，并在0.07%琼脂糖凝胶上进行电泳。对质粒PBrxl和PBrxl△复合的EcoRⅠ消化液也同样作了分析。
对于载体PAcyc184而言37Kb BamH7片段的两个定向都被确定，并分别称为质粒PBrx2和PBrx3。同样也观察到，三个EcoRⅠ片段位于自发地自质粒PBrx2及PBrx3丢失的22Kb DNA片段的当中。这三个EcoRⅠ片段的大小分别为18Kb、3Kb和1.9Kb。编码溴苯腈的特异性腈水解酶应该位于三个EcoRⅠ片段中的一个之中，否则腈水解酶的结构基因则被EcoRⅠ限制性位点所分开。
对于大肠杆菌(PBrx3)的溴苯腈特异性腈水解酶的位置作了研究。结果如下所示表1溴苯腈特异性脂水解酶是大肠杆菌的胞浆周围酶A 腈水解酶培养条件 专一活性toluenized细胞(L-肉汤) 0.829经溶菌酶处理的细胞(L-肉汤) 0.796完整细胞(L-肉汤) 0.770完整细胞(L-肉汤+Br×1) 1.25完整细胞(M9) 0.950完整细胞(M9+Brx1) 1.45完整细胞/PAcyc184(M9) 0a.
含有质粒PBrx3的大肠杆菌(3MM294)细胞在37℃下在指定的培养基5ml培养物生长至稳定时期。培养物含2oug/ml氯霉素和0.04%溴苯腈(Brx1)。从每一培养物中收获1ml培养物，用腈水解酶缓冲液(0.1MKPO4，PH7.5)洗一次并使细胞悬浮于0.1ml该缓冲液中。按照Harper在Biochem.J.(1977)第167卷685～692页上介绍的方法用或不用3mm溴苯腈作为底物对50μml样品的腈酶活性进行测定。
b.μmoleNH3/分·mg。对质白进行测定以O.D.600为1.4＝10细胞/毫升＝150μg。
该数据表明腈水解酶在细胞中的位置是胞浆周围空间中。所作的是第二个观察是，该酶在缺少溴苯腈的培养物中能表达，这就表明酶3的表达不需要溴苯腈的诱导。
溴苯腈特异的腈水解酶的进一步纯化克氏核囟(K.ozaenae)腈水解酶的进一步纯化具有下列的结果。
表2从大肠杆菌中提纯溴苯腈特异的腈水解酶(起始材料为6克细胞)组分体积蛋白 μmole NH3/分 S.A.b粗制a100ml 210mg 18.15 0.08635-50% 6ml 83mg 26.77 0.250(NH4)2SODEAE 56ml 19mg 15.52 0.820(Sephadex)交联葡聚糖a.
在30℃下，在含有0.04%溴苯腈和葡萄糖和M9培养基上，细胞生长至(midlog)。通过细胞破碎，经超离心并在含0.05MKPO4(PH7.5)和2.5mMDTT的缓冲液中进行透析制得粗提取物。在所有的腈水解酶测定中底物浓度均为3mM。
b.μmoleNH3/分ng规格为2.5cm×10cm的柱放在含0.05M KPO4(PH7.5)、2.5m MDTT和1mMEDTA的缓冲液中平衡。加入样品，在上述的缓冲液对柱用300ml0.02M至0.40M Nacl的线性梯度对柱进行洗脱。在梯度末端用含1M Nacl的缓冲液。收集5ml组分，并用其0.075m交替组分的等分试样进行腈酶活性的测定。单一酶活性的高峰在0.22M盐浓度时被洗脱。大约75%的输入腈水解酶活性被回收在活性组分中。
由DEAE柱得到的横跨腈酯活性峰的各组分在0.02MKPO(PH7.5)下透析，每个组分有50μl(6μg蛋白)加入到11.25%变性的胶中。与来自DEAE柱的活性所得到的峰的相对应的富集蛋白带是分子量为34，000的多肽。由柱分离的活性组分没有富集到其它的多肽。这些数据支持了这样的观点溴苯腈特异腈水解酶是一种分子量大约为34，000的多肽，并且可能是一个单一基因的产物。
克隆PBrx2用EcoRⅠ完全消化，并分离出一个大约为19Kb的片段。该片段插入到EcoRⅠ消化的PAcyc184载体(3.9Kb)从而提供如上所述转化进大肠杆菌的质粒PBrx5。该质粒用通常方法分离，并用于BglⅡ消化而获得大约6.7Kb的仍然插入在PAcyc184载体中的片段。分离的质粒PBrx7再用SmaⅠ及BglⅡ消化提供一个大约3.9Kb的被插入到Smal-BamHⅠ消化的PAcycl77(3.7Hb)中的片段。(Chang及Cohen著J.Bacteriol.(1987)134卷1141-1156)。所产生的能提供青霉素抗性的质粒如前所述被转化到大肠杆菌中，转化体在青霉素选择的培养基上进行选择，以提供将腈水解酶基因带到一个3.9Kb片段上的质粒PBrx8。
PBrx8用PstⅠ部份消化，片段被插入到PstⅠ消化过的PUC18上(yanisch-perron等著《基因》(1985)第33册103至119页)。所产生的质粒在大肠杆菌中被克隆并对其腈水解酶活性进行筛选。一个克隆具有5.3Kb质粒PBrx9被分离，并进一步用PstⅠ及HincⅡ消化，结果产生一个1210bp的沿自PstⅠ至HincⅡ、ClaⅠ、SalⅠ、ScaⅠ及SphⅠ其限制性位点的方向几乎均匀地分开的片段。P-stⅠ-HincⅡ片段是按照Sanger等在《Proc.Natl.Acad。Sci.USA》(1977)第74册5463～5468页中所述的方法进行顺序测定。所得到的顺序(以适当编码的氨基酸)陈列如下
基本上无5′-及用3′-非编码侧翼的PstⅠ-HincⅡ片段可以与EcoRⅠ联结子联结因EcoRⅠ消化，而后便可准备通过插入到PCGN451的EcoRⅠ位点而导入到植物的表达盒中。
PCGN451包括一个含有大约1，566bp的5-非编码区该非编码通过EcoRⅠ联结Ⅰ与基因的3′端及大约1，349bp的3′-非编码DNA融合的。根据Bar Rer等在《Plant Molecular Biology》(1983)2卷335页的确定，PTi协调在3′区域为11，207～12，823，而在5′区域为13，643～15，208。5′片段是以下列方法获得一个含有编码区的5′末端的小亚克隆片端称为一Bam HⅠ-EcoRⅠ片段被当作质粒PCGN407在PBR322中被克隆。Bam HⅠ-EcoRⅠ片段在编码区有一个XmnⅠ位点，而PBR322有两个XmnⅠ位点。PCGN40用XmnⅠ进行消化，用Bal31核酸酶切除，并用EcoRⅠ联接子加到这些片段中。经EcoRⅠ和BamHⅠ消化后，这些片段被按大小分段分离，再对分段分离物进行克隆及顺序分析。在一种情况下，完整的编码区和10bp的5′非转译顺序被取出，留下5′非转录区，mRNA Cap位点和16bp的5′非转译区保持完整(到BamHⅠ位点)。通过在7%的丙烯酰胺凝胶上按片段大小进行分段分离获得这样的小片段，并洗脱出大约130bp长的片段。将这种按大小分段分离的DNA与M13mp9联接，并对几种克隆进行顺序分析，并将这些顺序与已知的章鱼碱一合酶基因的顺序相比较。该M13结构被称为PI4，它的质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ消化以提供小的片段，以连接到包括p Ti A6上游的5′顺序的XhoⅠ到BamHⅠ片段(参见Garfinkel及Nester，J.Bacteriol，》(1980)144卷732页)及和包含3′顺序的EcoRⅠ到XhoⅠ片段上。所得到的XhoⅠ片段被克隆进入一个被称为PCGN-426 PUC8衍生物的XhoⅠ位点。该质粒不同于PUC8是因为具有其中充入DNA聚合酶Ⅰ的唯一的EcoRⅠ位点，并当一个XhoⅠ联接子插入到PUC8的独特HincⅡ位点时，由于HincⅡ限制性核酸内切酶的核酸酶污染而失去PstⅠ及和HindⅢ位点。所得到的PCGN451质粒具有一个单一的EcoRⅠ位点用于把蛋白质编码顺序插入到5′非编码区(该区含有包括T-DNA的右边界区和m RNA帽子位点和16bp的5′非转译顺序的1，550bp的5′非转录顺序)和3′区域(该区含有267bp的编码区、终止密码子、196bp 3′-非转译DNA、polyA位点以及1，153bp的3′-非转录顺序)之间。
包含章鱼碱合酶(ocs)表达盒的XhoⅠ片段被插入到具有抗四环素和卡那霉素(Kanamycin)抗性基因的质粒PCGN517。PCGN517是从PHC79通过转导进来自PUC4的独特的PstⅠ位点、Karn基因而制得(参见Vieira著《Gene》(1982)19卷259页PCGN517用SalⅠ消化，并将XhoⅠ片段插入到独特的SalⅠ位点上。
该XhoⅠ片段也同样插入到第二个质粒PCGN529中。PCGN529是通过将来自Tn5的Karn基因(参见Rothstein等者(1981)《Movable Genetic Elements》中99页，Cold Spring Harbor实验室，Cold Spring Harbor，纽约)和一个来自p RiA4 T-LDNA的2.4Kb的BglⅡ片段(参见White和Nester著《J.Bacteriol》(1980)144卷710页)插入到在用Tn5的Karn基因取代p Acycl84的HindⅢ-BamHⅠ片段后仍然保留的BamHⅠ位点上而制得的。
包含ocs表达盒(在ocs表达盒的独特ECORⅠ处EcoRⅠ腈水解酶基因被插入的XhoⅠ片段被分别地插入PCGN517和PCGN529以质粒得到两个，PN1和PN2，这两个质粒PN1和PN2分别用于导入A.Tumefaciens或A.rhizogenes以整合到Ti及和Ri-质粒的TDNA中去。对各个质粒的整合可以按照Comai等在《plasmid》(1983)10卷21-30页中所描述的3-路杂交法(3-way mating)来完成。将含有质粒p RK2073、PN1或PN2的大肠杆茵宿主及和A.tumefaciens A722(参见Garfin Kel著《J.BacteriOl》(1980)144卷732页)或A.rhizogenes A4 T(参见white)著《ibid》(1980)144卷710页)过夜培养，将合适的培养物混合，并涂抹到含有150mg/ml卡那霉素的AB板上。进行再划线两次。通过对农业细菌DNA进行各个菌落分析来检验是否正确的整合。核酸内切酶消化的DNA用切口转译的p Br X8进行探测。
与A.rhizogenes共同培养的烟草叶片的转化和再生对烟草植物进行无菌培养25℃，白尖小时;Ms(1mg/l ⅠAA，0.15mg/ml激动素)通过主芽移植培养的三周龄的烟草植物被用作组织提供物。选择(自顶部数第四片)嫩叶，剪下直径为2mm叶圆片，置于盛有含1mg/l ⅠAA的1ml MS培养基的培养皿中。经避光过夜培养之后，将农业细菌(Agrobacterium)(A772xPN1或PN2)细胞(10-10/ml植物培养基)加入到这些培养物中。然后在避光的情况下进行18～24小时的共培养。用缺少激素的含350mg/cefotaxine的Ms培养基洗涤叶片三次，以去除农业细菌(Boehringer-Mannheim)。叶片被转移到盛有10ml不含激素的Ms培养基的培养皿(直径为9厘米)中。用石蜡对Phytagar(Gibco，0.6%;cefotaxine，350mg/l)培养皿进行封口，并置于同样条件下作为组织供体。将2～4周后出现的根割下，并置于在相同条件下加入2mg/l的LAA及2mg/l激动素的相同培养基中。在随后的2至5周可以看到有再生芽长出。
用溴苯腈溶液对载于盆中的处于6片叶阶段的植物进行直接喷雾。每株植物用一个4号花盆栽种，喷上2.5ml溴苯腈溶液。植物在一个温度为25℃，相对湿度70%的生长室中进行60小时的照光生长。喷雾后，直至新叶片长度超过0.5cm时，共生长了9天。
植物可以通过下列的步骤而获得对溴苯腈的抗性，并可在有溴苯腈存在下在田野种植而对它们的生长不产生不利的影响。
本发明通过使植物对除草剂特别是对一性间的苄腈除草剂产生抗性，而使植物得到改良。因此，编码腈水解酶的基因可以导入植物宿主中，由此，使该基因进行表达，并赋于植物对苄腈的抗性。此外，该酶可以通过将在通常的细菌宿主中克隆基因而进行表达。具有可检测的活性的酶具有广泛用途，可用于分析被分析物或苄腈底物。此外，该酶及表达该酶的细菌可以用于去除苄腈杀虫剂对环境的污染。
尽管前述的本发明为了便于理解起见，已经通过描述和举例而作了详细地说明，而对于在附属的权利要求
范围内所作的某些变化改进显然也是可行的。
权利要求
1.一种分子量大约为34，000道尔顿足够纯的细菌腈水解酶，以溴苯腈为底物，纯度至少具有比活性为0.1μmol NH/分·mg蛋白。
2.一种含有外来的可表达对于3，5-二卤-P-羟基苄腈具有特异性的腈水解酶的细菌宿主。
3.一种含有分子量大约为34，000道尔顿的腈水解酶的组成物，该组成物以溴苯腈(bromoxynil)为底物，比活性至少具有大约0.1μmol NH3/分.mg蛋白。
4.根据权利要求
3所述的组成物，其特征在于，其中的腈水解酶为细菌腈水解酶。
5.根据权利要求
4所述的组成物，其特征在于，所述的细菌腈水解酶是从豆氏杆菌(Klebsiella)中得到的腈水解酶。
6.根据权利要求
3所述的组成物，其特征在于，所述的组成物其比活性至少具有大约为0.5NH3/分.mg蛋白。
7.一种具有表达对于3，5-二卤-P-羟基苄腈具有特异性的腈水解酶的外来基团的细菌宿主。
8.根据权利要求
7所述的细菌宿主，其特征在于，所述的细菌宿主为大肠杆菌。
9.一种包括一个能在植物细胞中起作用的调节区的转录和转译调节控制下为溴苯腈(bromoxynil)和/或碘苯腈(ioxynil)特异的腈水解酶编码的结构基因的表达盒(Cassette)。
10.根据权利要求
9所述的表达盒，其特征在于，其中所述的腈水解酶是细菌腈水解酶。
11.根据权利要求
9或10所述的表达盒，其特征在于，所述的盒至少有一个T-DNA边界区(border)
12.根据权利要求
9至11中任一项中所述的表达盒，其特征在于，其中所述的转录起始区域是从编码奥派因(opine)的基团开始的。
13.一种能够在含有如权利要求
9所述的表达盒的大肠杆菌及A.tumefaciens中的至少一个中进行复制的质粒。
14.根据权利要求
13所述的质粒，其特征在于，其中所述的表达盒至少有一个T-DNA边界区(border)。
15.一种如说明书所列举的DNA顺序，说DNA顺序联结到和处在转录调节区控制下而不是联结到在克氏杆菌(Klebsiella)中发现的对溴苯腈和/或碘苯腈特异的细菌腈水解酶的野生型转录起始区。
16.根据权利要求
15所述的DNA顺序，其特征在于，其中所述的转录调节区是在植物中能起作用。
17.根据权利要求
15所述的DNA顺序，其特征在于，其中所述的转录调节区是在细菌中能起作用。
18.一种具有编码为对3，5-二卤-P-羟基苄腈特异的腈水解酶编码的开放读框架(open reading frame coding的DNA顺序，该顺序是在其5′未端的而不是野生型的转录起始区。
19.根据权利要求
18所述的DNA顺序，其特征在于，其中所述的腈水解酶是一种细菌腈水解酶。
20.根据权利要求
19所述的DNA顺序，其特征在于，该DNA顺序是与来自克氏杆菌(Klebsiella)的DNA顺序是基本上同源的。
21.一种包含如权利要求
9至12中任何一项所述的表达盒的植物细胞。
22.一种包含如权利要求
21所述的植物细胞的植物。
专利摘要
本发明提供对溴苯腈的腈基水解作用特异的腈水解酶、为该酶编码的核苷酸顺序，以及在其细胞中表达外源的腈水解酶的转化细胞。该转化细胞能表达腈水解酶以对环境进行解毒作用并保护对溴苯腈敏感的细胞免受细胞毒作用的影响。特别要使植物改良为对溴苯腈具有抗性。大肠杆菌菌株MM294(p Brx5)于1986年1月22日存放于A.T.C.C，并给予登记号53435。
文档编号C12N15/00GK87100135SQ87100135
公开日1987年9月2日 申请日期1987年1月8日
发明者斯待卡·大卫 申请人:罗讷—布郎克农业化学公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan